Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.





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jueves, 26 de mayo de 2016

La desinfección con UV produce un estado VBNC en Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa


Seguro que alguna vez te has preguntado de dónde y cómo obtenemos el agua potable. Se entiende como agua potable aquella que puede ser consumida por el humano sin restricción ya que tras un proceso de purificación ya no representa un riesgo para la salud. Si atendemos a esta definición podemos imaginar cómo de importantes son las técnicas de desinfección que hacen que el agua esté libre de microorganismos y agentes contaminantes y se pueda consumir de forma segura. Antes de que el agua sea considerada apta para el uso humano se hace un recuento del número de bacterias y/o patógenos, que son aquellos microorganismos capaces de causar enfermedades infecciosas. Si los niveles de estos microorganismos están dentro de un rango previamente estipulado se determina que es segura para el uso humano y se distribuye como agua potable. De esto podemos deducir cómo de importante es que las técnicas de desinfección que usamos sean eficientes.  Pero, ¿qué ocurre si nuestras técnicas de purificación no son tan eficaces como pensamos? ¿Qué ocurriría si el agua que consideramos segura tras los procesos de purificación siguiera siendo un riesgo para la salud? 

Antes ya hemos comentado que la forma de determinar si el agua es potable es haciendo recuentos de los microorganismos y patógenos que hay en ella. En este estudio se ha comprobado que realmente hay células que se escapan al recuento pero que están presentes en el agua y por tanto suponen una amenaza para la salud pública. 

¿Cómo puede ocurrir esto? 

Esto quiere decir que cuando se hagan los controles de seguridad del agua potable y se cuenten las colonias celulares las células en estado VBNC no van a ser contadas, aunque como hemos explicado suponen un riesgo para la salud y podríamos estar determinando como seguras y potables aguas que no lo son.

Hay muchos factores que inducen el estado VBNC en las bacterias y desafortunadamente uno de ellos es la radiación UV. En este estudio se comprueba la eficacia de desinfección de la radiación ultravioleta (rayos UV) y su capacidad de inducir el estado VBNC. Esta radiación es una forma de desinfección que no daña la envoltura de las células pero sí modifica el material genético de las células en su interior, su ADN, haciendo que estas mueran. Hasta ahora la radiación UV ha sido considerado un método muy efectivo de desinfección, más que otros como es el uso de cloro, y se emplea con relativa frecuencia. Sin embargo, este artículo nos plantea la cuestión de si el uso de UV es tan efectivo y seguro como se ha pensado hasta el momento ya que ahora se conoce la importancia del estado VBNC.

¿Cómo se ha sabido en este artículo que las bacterias son capaces de entrar en ese estado y determinar un riesgo para la salud? 


Como hemos explicado antes no somos capaces de cuantificar estas células porque no forman colonias, por lo tanto el recuento en placa, que es el método habitual mediante el cual se determina la seguridad del agua y consiste en cultivar bacterias en una placa Petri y contar manualmente las colonias que forman, es un método que ya no nos sirve. Por lo tanto las técnicas empleadas en este estudio que han permitido saber la existencia de este estado y determinar su importancia han sido otras: la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR) y la reacción en cadena de la polimerasa con propidio monoácido (PMA-qPCR). Las cepas de bacteria empleadas en el estudio fueron E. coli y P. aeruginosa que son patógenas y que normalmente se usan como indicadores de la presencia de bacterias patógenas, es decir, que si encontramos estas esperamos que también haya otras bacterias dañinas en el agua. Aunque las técnicas comentadas (RT-qPCR y PMA-qPCR) tengan nombres muy ostentosos básicamente lo que nos permiten es saber la actividad celular. Gracias a estas técnicas sabemos que las células siguen activas porque podemos ver como genes que son importantes para la actividad celular siguen estando activos. Así es como se ha sabido que estas bacterias no forman colonias y no pueden ser contadas pero siguen siendo activas y por lo tanto peligrosas para nuestra salud.


Figura 1.-  Comparación de la eficacia de los métodos empleados para detectar el estado VBNC. Fuente

Para comprobar la facilidad que tiene una bacteria de crecer en cultivos en condiciones normales,  los autores del artículo realizaron varios estudios. En uno de ellos, experimentaron con una serie de diluciones que fueron expuestas a luz UV para determinar el comportamiento de E. coli y P. aeruginosa. Si tras la radiación alguno de los tubos se volvía de un color turbio, se demostraba que las bacterias se recuperaban del estado VBNC tras cesar la radiación.


Figura 2-. Efiniciencia de inactivación de E. coli y P. aeruginosa después del tratamiento con UV usando dosis crecientes de esta radiación, basadas en el recuento en placa. "I" es la intesidad de la radiación y "T" el tiempo de radiación, por lo tanto "IT" es la dosis de UV.  Fuente


En este gráfico podemos ver como aumenta la eficacia de la inactividad en las bacterias a medida que aumentamos la intensidad y el tiempo de exposición a la radiación.
Los resultados mostraron que mayores dosis de radiación UV reducía la cultivabilidad de E. coli. y P. aeruginosa en todos los casos, como se puede observar en la figura anterior. Los mecanismos para la inactivación por luz UV de los microorganismos varían con la longitud de onda de la luz usada (a menor longitud de onda, más energética es la radiación y mayor daño produce en el microorganismo) y los daños causados por el tratamiento con UV inhiben la división celular, de modo que el microorganismo entra en estado VBNC. 

Continuando con dicho experimento, se examinó la capacidad de activación de las células de E. coli y P. aeruginosa  desde el estado VBNC, esto es si las bacterias podían dejar de estar en el estado VBNC y volver a activarse siendo capaces de formar colonias de nuevo. Para ello se cultivaron muestras de las bacterias que anteriormente habíamos irradiado con luz UV, obteniendo los resultados de la siguiente tabla.


Tabla 1.- Las unidades de los valores dentro de la gráfica están en CFU/mL. CFU: Unidades formadoras de colonias. Tabla que muestra la reversión del estado VBNC en E. coli y P. aeruginosa. Fuente

En esta tabla lo que obtenemos es  la concentración de bacterias que han crecido en nuestros cultivos, tras haberlas dañado con luz UV, donde los resultados muestran  que cuando E. coli y P. aeruginosa entran en un estado VBNC, pueden salir de él si las condiciones son las apropiadas, pero en el caso de  E. coli, podemos ver que puede revertir dicho estado más fácilmente que P. aeruginosa ya que crecen más colonias en los cultivos. Se piensa que esta capacidad de revertir el estado VBNC es una adaptación de las bacterias para sobrevivir pero que desgraciadamente para los seres humanos supone un riesgo para la salud.

Este estudio nos ayuda a concluir que se debería seguir investigando este ámbito con el fin de desarrollar estrategias que reduzcan eficazmente los patógenos en los sistemas de tratamiento de agua potable. Es importante mejorar la seguridad biológica de la desinfección por UV, desarrollar otros métodos más efectivos o incluso proponer combinación de métodos. 

Tras haber planteado esta controversia respecto a la desinfección por UV creemos importante dar a conocer algún método nuevo de los que se están desarrollando para la desinfección de agua potable:

Según recientes noticias, un equipo internacional de investigación ha desarrollado un fotocatalizador que promete, no solo la desinfección rápida y eficaz del agua, si no la mejora al método tradicional de radiación con UV. La peculiaridad de este fotocatalizador es que en lugar de utilizar luz UV, emplea luz visible y funciona incluso en la oscuridad. Está compuesto por fibras de óxido de titanio, que elimina parte de las bacterias presentes en el agua, acompañadas de nitrógeno. Además, han incorporado pequeñas partículas de paladio a la superficie de dichas fibras, aumentando notablemente la eficacia de la desinfección debido a la formación de estructuras químicas que afectan a las bacterias.

En conclusión se hace bastante evidente que hay que llevar a cabo más estudios sobre la eficacia y posible peligrosidad del uso de UV, además de potenciar el desarrollo de técnicas como estas que acabamos de introducir que pueden suponer una innovación y tras su desarrollo su abaratamiento podría suponer la sustitución total del uso de UV por métodos más eficaces y seguros.


  • Toda la información ha sido obtenida del siguiente artículo:   
Zhang, Z., Ye, C., Lin, H., Lv, L. y Yu, X. (2015). UV Disinfection Induces a Vbnc State in Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Environmental Science & Technology, 49 (3), 1721−1728.


  • El grupo de trabajo está formado por: Lourdes Alcañiz Pascual, María Cabrera Cabrera, Jorge De Andrés López, Nerea Gutiérrez Nájera, Mónica Hortal Foronda y Carmen María Pérez Hernández

jueves, 29 de mayo de 2014

Ingeniería genética en Escherichia coli para mejorar la producción de etanol a partir de gluconato

Actualmente se está experimentando una creciente demanda energética. La utilización de combustibles fósiles para suplir las necesidades energéticas conlleva una serie de consecuencias perjudiciales; como puede ser el incremento de CO2 emitido a la atmósfera (resultado de la combustión de dichos combustibles) o la lluvia ácida. Es por ello que la utilización de biocombustibles como el etanol resulta una fuente de energía alternativa que es cada vez más prometedora. Concretamente, la biomasa celulósica presenta un bajo coste de producción y es muy abundante. A partir de la hidrólisis de la biomasa celulósica se obtienen tanto hexosas como pentosas, entre otros azúcares, que pueden ser transformados en biocombustibles como el etanol, mediante la actuación de microorganismos fermentadores.
Aunque existen microorganismos etanogénicos, estos se ven limitados por su capacidad para utilizar pentosas como sustratos (constituyendo estas el 90% del total de biomasa celulósica). Es decir, son homoproductoras de etanol (no producen ningún otro producto final), pero son incapaces de utilizar la fuente de monómeros más importante en la biomasa celulósica; las pentosas.
Por otro lado, Escherichia coli, aunque carece de la capacidad para producir etanol como único producto final, sí presenta la habilidad de utilizar diversos tipos de azúcares como sustrato, obteniendo rendimientos mayores de la biomasa celulósica. Además, es capaz de asimilar con mayor velocidad el gluconato, presente en la biomasa celulósica.


 ESCHERICHIA COLI Y METABOLISMO

Con el objetivo aprovechar las ventajas que presenta Escherichia coli, el estudio se centra en el metabolismo de esta bacteria anerobia facultativa. Éste se puede dividir en dos fases principales; la degradación de los carbohidratos para obtener piruvato y la degradación de éste (diferente en condiciones aeróbicas y anaeróbicas).
Las diferencias que supone la utilización del gluconato como fuente de carbono alternativa a la glucosa derivan de su  producción energética en la via de Entner-Doudoroff, convirtiéndose en piruvato (menor producción energética con respecto a la glucólisis).  En condiciones anaeróbicas se producen 2 moles de ATP y dos de NADH por mol de glucosa para dar piruvato; mientras que con gluconato solo se obtiene 1 mol de ATP y 1 mol de NADH. Para compensar esta diferencia (pérdida) de ATP, las bacterias sintetizan más productos oxidados como el acetato (que rinde ATP y NADH), produciendo lactato y etanol, con el objetivo de controlar la concentración de NADH.
Una vez obtenido el piruvato, este puede degradarse a través de cuatro rutas distintas, resumidas en el siguiente esquema:
Vías metabólicas por las que puede degradarse el piruvato (fermentaciones)

Durante el estudio realizado por los investigadores, se aprovecha la capacidad de E. coli para metabolizar diferentes productos, realizando una serie de experimentos para determinar cómo es posible incrementar el rendimiento en la producción de etanol (y disminuir la de acetato y lactato).


MATERIALES Y MÉTODOS

Para los distintos experimentos se trabajó con la cepa E. coli K011, construida mediante la integración de la ruta de producción de etanol de Zymmonas mobilis (operón PET). E. coli K011 fue transformada para llevar a cabo los experimentos en diferentes cepas que se han obtenido a partir de esta. Para la obtención de dichas cepas se han noqueado distintos genes (codifican enzimas que participan en las rutas metabólicas fermentativas) por recombinación homóloga en diferentes combinaciones de estos genes noqueados. De este modo, se pudo estudiar qué efectos producen los genes modificados en el metabolismo de la bacteria: crecimiento, productos y rendimiento. 

En los experimentos, el medio de cultivo sobre el que se ha llevado a cabo las fermentaciones contiene medio LB (Luria Bertani) y 2 % de glucosa, además del sustrato (glucosa o gluconato). El pH fue ajustado a 6.5 y se consiguieron condiciones anaerobias. Las muestras fueron extraídas a distintos intervalos de tiempo para determinar la concentración de los metabolitos y la masa celular.


RESULTADOS

- Crecimiento:
Velocidad de crecimiento máxima de E. coli K001 y las estirpes mutantes con glucosa o gluconato

Cuando la glucosa es utilizada como fuente de carbono, todas las cepas son capaces de producir la fermentación de dicho compuesto, dando lugar a etanol como producto principal (más de un 100% del máximo teórico es alcanzado). Sin embargo, E. coli K011 produce una pequeña cantidad de acetato.

Utilizando gluconato como sustrato se pueden observar tendencias similares en los mutantes a cuando se utiliza glucosa, aunque se aprecia que todas las cepas que se estudiaron utilizaban el gluconato con mayor rapidez que la glucosa, alcanzando velocidades de crecimiento mayores. El rendimiento de producción de etanol en E. coli K011 es de un 87.5% comparado con el rendimiento teórico (sin embargo, el rendimiento de acetato aumentó hasta 117%).

- Producción de etanol:

 El consumo de piruvato se encuentra desviado hacia la producción de acetil-coA. La enzima PDH es inhibida por NADH en condiciones anaerobias, pero la enzima LDH no requiere NADH para su funcionamiento. Por lo tanto, las dos vías catalizadas por estas enzimas están reguladas por NADH y evitarán la competición entre ellas. Sin embargo, la actividad de PDH no es nula en condiciones anaerobias: funciona para mantener el equilibrio entre NADH y NAD+.
Cuando se usa glucosa, el ratio NADH/NAD+ es mayor porque la glucosa es un sustrato más reducido. Esto causa que PDH quede inhibida y la producción de etanol aumente por la presencia de NADH.
Al utilizar gluconato como sustrato, la producción de acetato en general aumenta, ya que se utiliza esta vía para compensar la pérdida de ATP con respecto a la utilización de glucosa como sustrato. Además, se debe mantener un equilibrio entre NADH y NAD+, consumiéndose el exceso de NADH gracias a la formación de lactato y etanol.
Teniendo estos dos factores en cuenta, la estrategia utilizada para mejorar la producción de etanol en E. coli K011 consiste en el noqueo de los genes pflA y ldh en conjunto. El noqueo de pflA hace que solo se pueda producir acetato y ATP a la vez que NADH a través de la ruta catalizada por PDH. El exceso de NADH producido por esta vía solo puede compensarse con la producción de etanol, ya que el gen ldh también está noqueado. Por lo tanto, esta combinación es la óptima si se desea mejorar el rendimiento en la producción de etanol.

CONCLUSIÓN

Aunque la eliminación de rutas metabólicas competentes no produzca una mejora muy notable de la producción de etanol cuando se utiliza glucosa como sustrato, sí que se aprecian diferencias importantes utilizando gluconato.
En el experimento se consiguió aumentar el rendimiento de la producción de etanol a partir de gluconato gracias a al noqueo de pfl y ldh en conjunto. Sin embargo, el noqueo de estos genes afectan moderadamente a la velocidad de crecimiento de las bacterias, disminuyendo esta velocidad a un 70% de su valor en la cepa silvestre (E. coli K011).



ARTÍCULO ORGINAL

Amanda Hildebrand, Theresa Schlacta, Rebeccah Warmack,Takao Kasugab Zhiliang Fan, "Engineering Escherichia coli for improved ethanol production from gluconate", Journal of Biotechnology168 (2013) 101– 106.

*Las dos primeras imágenes han sido tomadas del artículo original


TRABAJO REALIZADO POR: 
Samuel Daniel Lup, Esther Marhuenda Segarra, Adrián Martínez Tébar, Elisa Pérez Galiano y Marta Rubio Camacho