Producción y caracterización de ectoína por Marinococcus sp. ECT1 aislado de un entorno de alta salinidad.

Seguramente, querido lector, al leer el título de esta entrada se encuentre en la misma situación que antes de hacerlo ¿Qué o quién es Marinococcus sp.ECT1? y ¿qué es la ectoína? Son preguntas que habrán rondado su cabeza. No se preocupe, vamos a responderlas punto por punto y, quizá, incluso consigamos que comprenda el proceso experimental que hay detrás de ellas. Vamos allá.

Salar de Uyuni, medio similar al de Marinococcus ECT1.
Cortesía de TravellersBook.net

   Marinococcus sp. ECT1 es una bacteria, del tipo coco (forma más o menos esférica), descubierta por investigadores taiwaneses en un campo de sal de la isla de Taiwan. Por vivir en esas condiciones tan  salobres esta bacteria, al igual que muchas otras de su entorno, necesita desarrollar un mecanismo de defensa para adaptarse al estrés osmótico en entornos hiperosmóticos, pero ¿qué significa esto realmente? En algún momento de su vida le habrán dicho que no debe beber agua del mar, porque eso le produciría, paradójicamente, una pérdida de líquidos. Dicho de otra forma, hablamos de efectos osmóticos. Ya saben, el paso de disolvente de la cavidad menos concentrada a la más concentrada por una membrana para igualar las concentraciones; y esto es exactamente lo que la mencionada Marinococcus sp. ECT1 necesita evitar. Imagínese, vivir en medio de un desierto de sal no debe ser muy favorable en cuanto a pérdida de agua se refiere. ¿Cómo evitan, por tanto, este fenómeno? Con los llamados solutos compatibles: compuestos que las células, en este caso las bacterias, acumulan en su interior para evitar el paso de fluido a un medio más concentrado. Y aquí es donde entra en juego la ectoína, un compuesto que podrán encontrar en los protectores solares que pronto empezarán a usar. El interés por tanto radica en que una bactería que vive en un medio tan extremo, osmóticamente hablando, como puede ser Marinococcus sp. ECT1 podría llegar a ser una gran productora de ectoína con una buena aplicación en la producción industrial. Y en esto se basa el experimento precisamente: en obtener las condiciones de laboratorio óptimas en las que obtener una producción de ectoína máxima y compararla con otras producciones ya conocidas para valorar su posible uso industrial.

    Partiendo de la cepa ECT1 se procedió a su cultivo añadiendo células a un Erlenmeyer que para producir una fermentación (producción de ectoína) líquida. Dicho Erlenmeyer contenía un medio de cultivo conocido como YCMS, a saber: medio salino con extracto de aminoácidos de levadura. Se escogió este medio tras compararlo con otros disponibles (caldo de lisogenia, principalmente) y certificar un mayor rendimiento en cuanto a crecimiento bacteriano y, por tanto, de producción de producto de interés. Pero no solo del medio inicial de cultivo depende el correcto crecimiento bacteriano. Diversos factores fueron estudiados con el objetivo de determinar las condiciones ideales para la producción de ectoína, entre ellos: temperatura, pH, velocidad de agitación del cultivo, concentración de sal, diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, alimento imprescindible para las bacterias; y la concentración de extracto de levaduras. La mayoría de estos análisis se llevaron a cabo mediante prueba y error. Tras establecer unas condiciones de crecimiento y dejar a las bacterias crecer se determinó la concentración celular, siendo el último paso la purificación de la ectoína producida y el análisis de esta para certificar su pureza y calidad.

Análisis para medir la influencia
de la temperatura en la producción de ectoína.
Yu-Hon Wie et al.

Influencia de la concentración de extracto de levadura
en la producción de ectoína.
Yu-Hon Wie et al.

    La purificación se llevó a cabo con un primer proceso de centrifugación del cultivo, separando así las células del medio de cultivo. La parte sólida que queda de la centrifugación, se mezcló con etanol, cloroformo y agua en proporción 1:1:1 para, posteriormente, centrifugar esta disolución. Se dejó secar en un horno a 100º C, se volvió a disolver en etanol y se filtró a través de un filtro compuesto por carbón activado. Este carbón activado se separa del etanol hirviéndolo. El extracto final se seca a 100º para eliminar el etanol remanente, obteniendo así ectoína purificada.

  Una vez obtenida la ectoína era necesario realizar un análisis para determinar su estructura química y así poder confirmar que Marinococcus sp. ECT1 es productora de una ectoína que cumple las expectativas deseadas para el producto. Partiendo de una ectoína suministrada por Sigma-Aldrich, se utilizó esta como muestra patrón que marcaría los estándares a alcanzar por la ectoína de Marinococcus sp. ECT1. El análisis se realizó con pruebas como la resonancia magnética nuclear y la espectrometría de masas. Ambas pruebas demostraron que el compuesto sintetizado responde a los estándares de la ectoina, permitiendo conocer también que la ectoina procedente de Marinococcus sp. ECT1 puede contener sales de cloro y demostrando pues, que es una nueva cepa con la que producir ectoína.

Resultado del análisis de resonancia magnética nuclear para ectoína sintetizada por Marinococcus sp. ECT1.
Yu-Hon Wie et al.

   Marinococcus sp ECT1 tuvo un rendimiento en la producción de ectoína igual, o superior, que otros géneros de bacteria utilizados para la producción por lo que sí resultó ser viable para su explotación industrial. Además, el estudio muestra, por primera vez, que Marinococcus sp. ECT1 puede sintetizar ectoina y que la bacteria crece y sintetiza ectoína cuando crece en un medio salino, siendo la tasa de producción la máxima cuando el medio se encuentra en las siguientes condiciones:

Concentración de NaCL: 2M ; 442 mg/L de ectoina como producción máxima.

Fuente de carbono: 40 g/L de extracto de levadura (YE); nivel de producción máxima 2.5 g/L

Tipo de cultivo: cultivo en batch.

Temperatura: 30ºC

pH = 7

Grado de agitación: 200 rpm

   Estas condiciones y resultados son específicas del trabajo de laboratorio y están lejos de tener un una aplicación directa a nivel industrial, por lo que el objetivo actual es desarrollar una estrategia de fermentación para la producción de ectoina que sea práctica para su uso industrial.

BIBLIOGRAFÍA BÁSICA:

Yu-Hong Wei, Fang-Wei Yuan, Wei-Chuan Chen, and Shan-Yu Chen. Production and characterization of ectoine by Marinococcus sp. ECT1 isolated from a high-salinity environment. Journal of Bioscience and BioengineeringVOL. 111 No. 3, 336–342, 2011

ENTRADA REALIZADA POR:

Yeray López Aniorte
Marina Terol González
Jorge Ruiz Ramírez
José Marcos Berna Belmonte
María Elizabeth Salvador Mira 

Producción rentable de celulosa bacteriana en cultivos estáticos utilizando el liquido residual de la destilación

La celulosa es un producto de uso cotidiano, por lo que hay una gran demanda comercial. Esto ha llevado al intento de mejora de la producción para que sea más eficiente y más rentable.

Existen principalmente 2 formas de producir celulosa:

·           A partir de los árboles: la celulosa obtenida requiere un tratamiento adicional para retirar la lignina. Este es un material que confiere resistencia a los árboles y, por tanto, difícil de eliminar, por lo que es muy costoso.

·            A partir de bacterias como Gluconacetobacter xylinum: usa la celulosa para mantenerse a flote en un medio acuoso que contiene los nutrientes y poder a la vez tener acceso al oxígeno del aire.

Tradicionalmente el medio en el que se produce Celulosa Bacteriana (BC) está formado por HS (Hestrin and Schramm), que tiene un alto contenido en azúcares usados por la bacteria tanto para crecer como para producir la celulosa, polímero de glucosa. Sin embargo, este método es bastante caro, por lo que se han estudiado alternativas.

Una de estas alternativas es el uso del líquido residual de la destilación del vino de arroz llamado TS (Thin stillage). Este residuo es muy contaminante, por lo que supone un coste para la empresa deshacerse de él. Por ello, cederlo para la producción de celulosa, además de abaratar los costes de producción de BC, evita el gasto económico para la destilería al procesarlo.

Se ha estudiado la influencia de la composición de los medios de cultivo en el tiempo de producción de BC,  sus características estructurales y la rentabilidad de la producción.

MEDIOS DE CULTIVO

Se usaron medios con diferentes proporciones de HS y de TS.

Como se muestra en la figura, la concentración de células y de BC aumenta conforme se incrementa la cantidad de TS. Pero, al  aumentar más de un 50% la proporción de TS, se observa un descenso notable en estos factores.

Esto indica que la máxima producción de BC solo se obtiene en un medio en el que haya un 50% de TS y otro 50% de HS (50/50 HS/TS).

Para comprender esto es necesario saber cómo se comporta la bacteria en cada medio. En medio formado exclusivamente por HS, el aporte mayoritario,  la glucosa, es usada tanto para el crecimiento celular como para  la producción de celulosa. Por otra parte, en medio formado exclusivamente por TS es necesario generar glucosa a partir de los ácidos orgánicos (aporte mayoritario de este medio)  para sintetizar celulosa. Y en medio mixto los ácidos orgánicos del TS se usan para el crecimiento y la glucosa del HS para celulosa.

TIEMPO DE PRODUCCIÓN DE BC

Los medio usados en este caso son: 100% HS, 50%HS (50% agua y 50% HS), 50/50 HS/TS, 100%TS y 50% TS (50% agua y 50% TS).

 En los medios con HS la concentración de glucosa se reduce hasta un nivel muy bajo durante los 3 primeros días debido a que la célula la incorpora y lo transforma en energía.

Por el contrario en los medios con TS, la concentración de glucosa se mantiene prácticamente constante dado que lo que usa la bacteria en este caso son los ácidos orgánicos del medio.

También se observa en esta gráfica que, en el medio 50-50, la masa de células, junto con la producción de BC, a los 7 días es mayor que en el resto de medios.

CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE LA CELULOSA BACTERIANA

También se estudió el efecto del TS sobre las características estructurales de la Celulosa Bacteriana (BC) producida.

Películas de BC en bruto (no tratados)

La celulosa producida con el medio de TS  tiene un color más oscuro que la celulosa producida con los medios HS. Además la capa de celulosa con el medio 50/50 es de mayor grosor que el resto, como ya se ha comentado, por la mayor concentración celular y producción de celulosa.

Películas de BC tratadas con NaOH

Tras tratar la película de celulosa con NaOH, lo cual elimina las bacterias se obtuvieron películas blancas de Bc, de lo que se deduce que el color era debido a la presencia de los microorganismos. A mayor número de microorganismos, el color es más oscuro en los no tratados con NaOH.

También se observó que no hay diferencia en la estructura reticular ni en el tamaño de las fibrillas de celulosa entre los distintos medios. La celulosa obtenida con los medios que contienen TS es más densa en fibrillas, por lo tanto, tiene una menor capacidad de absorción: al ocupar más espacio las fibrillas hay menos espacio para los compuestos absorbidos.

RENTABILIDAD DE LA PRODUCCIÓN DE BC

 El abaratamiento de la producción de BC está basado en el uso de TS para reemplazar una parte del medio de HS. El coste de materias primas se reduce a la mitad debido a que el TS del TS-HS 50% es gratis. Además,  para producir la misma cantidad de BC en un medio mixto (TS-HS) que en un medio puro HS, la producción se abarata en un 67% (TS-HS). Si se usa un medio 100% TS, aunque sea gratuito, la producción de celulosa es la mitad que la del medio TS-HS 50%, por lo que el medio 50/50 es la mejor elección.

ENGLISH ABSTRACT

Bacterial Cellulose (BC) is traditionally produced in Hestrin and Schramm (HS) culture mediums using A. xylinum, but it is an expensive method. Researches Jyh-Ming Wu and Ren-Han Liu have conducted a study where Thin Stillage (TS) from rice wine destillation was used as a culture medium, totally or partially substituting HS medium, in order to improve the profitability of BC production and to solve the enviromental problem of TS (it is a pollutant). Several experiments concluded that 50/50 HS-TS medium was the most profitable medium and that it retained the structural characteristics of the BC produced in HS medium.

Artículo tratado:

"Cost-effective production of bacterial cellulose in static cultures using destillery waste water"

Autores:  Jyh-Ming Wu y Ren Han-Liu

Publicado en: Journal of Biosciencie and Bioengineering, VOL 115 No. 3,284-290, 2013

Producción de ácido propiónico mediante PFB

La producción masiva actual de ácido propiónico está basada en la industria petroquímica. Debido al coste, al impacto medioambiental y a la creciente preferencia de la sociedad por el uso de materiales biológicos se ha comenzado a investigar otras formas de producirlo como a través de fermentaciones anaerobias con Propionilbacterias.

Molécula de ácido propiónico

El ácido propiónico es un ácido carboxílico que puede encontrarse naturalmente y que tiene una gran diversidad de usos en la industria alimentaria, farmacéutica, etc.

Este estudio intenta mejorar la eficiencia de producción de ácido propionico, para ello se van a estudiar los beneficios de un cultivo inmovilizado utilizando bagazo de caña de azúcar, el cual es un material ecológico y barato.

Empezaremos hablando de que es un  biorreactor, clave en este proceso.

Un biorreactor es un sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o  sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos.

Bagazo de caña de azucar

En el biorreactor se utilizaron dos técnicas: la libre  y la inmovilizada con caña de azúcar. La ventaja de esta última recae en que la inmovilización celular logra aproximar las células así como aumentar la densidad celular y la concentración de metabolitos dentro de las células por ello es un método mucho más eficiente y logra rendimientos muy superiores a los del libre.

Ahora pasaremos a introducir la discusión del experimento y los resultados que se exponen en el artículo.

 Las células inmovilizadas han resultado ser más productivas, se observa una mayor producción de propionato por unidad de tiempo y una menor cantidad de ácidos orgánicos que se desvían de la ruta (acética y succínica). (Primera gráfica: libres; segunda: inmovilizadas). En la gráfica vemos como el ácido propiónico aumenta más (círculos negros) y la biomasa disminuye (círculos blancos), así como los ácidos orgánicos (cuadrados negros y blancos).

Gráfica comparativa entre fermentación libre (izqda) e inmovilizada (dcha)

Se estudia el método de introducir la glucosa y su influencia en la producción de ácido propiónico: de manera intermitente o de manera constante. Ésta última ha resultado ser más beneficiosa y productiva, ya que la intermitente produce alteraciones metabólicas. En la primera gráfica el ácido propiónico no aumenta tanto como en la segunda (puntos negros gordos) y la glucosa (puntos negros pequeños) se introduce de distintas formas: primera, de manera intermitente; y segunda, de manera continua.

Gráfica comparativa entre fermentación discontinua (izqda) y continua (dcha)

Con las condiciones del PFB (Reactor con una cama de plantas) podemos observar un cambio morfológico en las bacterias: crecen de tamaño aumentando el área de superficie específica beneficiando el intercambio de sustancias.

Se midieron las distribuciones de flujo de carbono y se comparó la producción de ácido propiónico  de los dos tipos de fermentación. Vieron que el flujo que daba lugar a moléculas que más tarde dserían precursores de  este ácido era mayor cuando había una fermentación PFB que cuando las células estaban libres. También se comprobó que la biomasa producida en PFB era también mayor. De esto se concluyó que la fermentación con células inmovilizadas en PFB era mucho más factible.

Se analizaron también los nodos de la ruta de síntesis de propiónico, que son el G6P (Glucosa-6-fostato), PEP (FosfoenolPiruvato) y PYR (Piruvato). De ahí se puede observar que:

Ruta metabólica de la bacteria

G6P: Deriva a la ruta de las pentosasfosfato, a rutas de biosíntesis y la glucólisis, que es la que  nos interesa.

PEP: Se transforma en oxalacetato, que da lugar a succínico, y en pirvato.

PYR: El piruvato se transforma en ácidoláctico, ácido ácetico (que no nos interesan)  y en ácido propiónico.

Se vio que en la fermentación PFB, en el nodo (lugar de bifurcación de flujos) de PEP el flujo se veía desviado hacia la formación de piruvato, reduciéndose la formación de succínico. Mientras, en el nodo de PYR esta misma fermentación aumenta el porcentaje de precursores del propiónico. La fermentación continua sugiere que el PFB produce una distribución de los flujos hacia los 3 nodos de síntesis de ácido propiónico.

La cantidad de alimento debe ser moderado para que su exceso no de lugar a cambios ambientales que consecuentemente perturben el balance metabólico. Aún así, el fed-batch constante es más efectivo con PFB inmovilizado que con el intermitente.

A continuación vamos a mostrar la actividad enzimática de ciertas proteinas frente a distintos medios y a distintas condiciones:

Gráfica comparativa de la actividad de las enzimas G6PDH y PPC

La G6PDH y la PPC aumentan su actividad con la fermentación PFB en comparación con las células libres , lo que se traduce en un aumento de la ruta de las pentosas fosfato y la transformación de PEP a OACE.

Gráfica comparativa de la actividad de las enzimas PTA y ACK

La PTA y ACK disminuyen su actividad con PFB con respecto a las células libres. Son enzimas que desvían el flujo hacia productos que nos son PA. Nos interesa esta disminución de actividad porque se desvía la mínima cantidad de carbono hacia productos que no sean PA.

Gráfica comparativa de la actividad de las enzimas OTC y CoAT. Aumento de la actividad en PFB.

La OTC y la CoAT aumentan su actividad en PFB en comparación con las células libres, que se traduce en cada caso en un aumento de producción de:

                        -OTC: aumento formación de PPCoA precursor de PA

                        -CoAT: realiza la transformación de PPCoA en PA

Se concluyó que:

Mediante PFB se ha obtenido la concentración máxima con diferencia de ácido propiónico por métodos biológicos hasta la fecha,  frente a otros métodos como la fermentación con células libres o el lecho de algodón, en FBB[i] y en  MFB[ii]. También se ha observado un cambio morfológico notable tras la domesticación en PFB. Además el estudio de los flujos metabólicos muestran una redistribución del flujo metabólico hacia la producción de a. propionico sin modificación genética.

En definitiva el reactor PFB ha demostrado ser un método sencillo y barato de aumentar la eficiencia de la producción de a. propiónico.

Referencias:

Artículo Original: “Propionic acid production in aplant fibrous-bed bioreactor with immobilized Propionibacterium freudenreichiiCCTCC M207015”         

Autores: Fei Chena, Xiaohai Fenga, Hong Xua, Dan Zhanga, Pingkai Ouyang.

Integrantes del Grupo 7:

Alicia García 

Natalia González 

Melisa Pinilla

Joaquín Rives 

María Romo

Bacteriocinas en el queso

PRODUCTORES DE BACTERIOCINAS EN QUESO

Durante los últimos años, el consumidor se ha vuelto más exigente en cuanto a calidad y expectativas de un producto saludable y fresco. Para satisfacer al consumidor es necesario investigar y encontrar opciones que permitan obtener alimentos que ofrezcan características interesantes renunciando al uso de algunos conservantes artificiales que puedan estar cada vez más rechazados y favoreciendo el uso de sustitutos que sean capaces de mantener el alimento en buenas condiciones y sean aptos para el consumo.

 En ésto se basa el estudio realizado por los autores del artículo Bacteriocins produced by wild Lactococcus lactis strains isolated from traditional, starter-free cheeses made of raw milk, orientado a la identificación de bacterias productoras de bacteriocinas con el fin de inhibir una amplia gama de microrganismos, incluídos microorganismos patógenos, lo que ha abierto un nuevo campo de investigación para tratar a pacientes con cepas resistentes a los antibióticos ya existentes, y algunos causantes del deterioro de los alimentos.

Para ello intentaron determinar qué cepas son productoras de bacteriocinas, bajo qué condiciones, y de qué bacteriocinas en concreto. Además de identificar los genes implicados en la formación de estos compuestos.

El procedimiento experimental seguido por los investigadores fue el que sigue:

1.                  Identificación y clasificación de aislamientos de Lactococcus Lactis:

Se aislaron 306 muestras de cinco distintos quesos tradicionales españoles (Casín, Cabrales, Genestoso, Peñamellera y Valle del Narcea). Mediante REP y RAPD se identificaron 60 cepas distintas, cada una de ellas con una huella dactilar característica. A partir de estas cepas se identificaron diferentes subespecies de L. lactis, lactis y cremoris mediante ARDRA.

2.                  Actividad antimicrobiana de cepas de L. lactis:

Tras haber identificado los tipos de microorganismos presentes en los aislamientos se procedió a identificar aquellas cepas que tuvieran actividad antimicrobiana poniéndolas en contacto con bacterias indicadoras primero se realizó un agar spot test para ver qué bacterias indicadoras eran inhibidas por qué cepas de los aislamientos obtenidos de los quesos.

Para asegurar que esta información obtenida fuese correcta se realiza un well-difussion assay mediante el cual se obtuvo que el número de cepas que daban un resultado positivo para la actividad antimicrobiana se redujo a 17 cepas.

3.                  Identificación de los genes que codifican bacteriocinas por PCR:

Para poder determinar en qué cepas estaban los genes productores de bacteriocinas, y cuales eran producidas por cada cepa, se diseñaron cebadores complementarios a los genes que codifican para nisina, lacticinas y lactococcinas, y mediante PCR se amplificaron las secuencias del genoma de cada cepa que complementaba con dichos cebadores. Posteriormente se sometieron a electroforesis para determinar, según el tamaño de cada banda, qué bacteriocina codificaba cada cepa.

4.                  Producción de bacteriocina en medio industrial y en laboratorio:

Más tarde se pasó a cuantificar la actividad inhibitoria de la nisina, comparando la de la obtenida en el laboratorio, con la comercial y también en distintos medios.

Además del descubrimiento de bacterias nuevas, también es importante para identificar cepas productoras de cantidades mas altas de antimicrobianos (particularmente los de amplio espectro) para su aplicación comercial.

En conclusión, en este experimento se descubrieron 17 productores de bacteriocinas de las 60 cepas estudiadas, 11 de los cuales producen nisina, 5 lactococcina 972 y 1 lactococcina G.

Referencia bibliográfica:

Bacteriocins produced by wild Lactococcus lactis strains isolated from traditional, starter-free cheeses made of raw milk 
International Journal of Food Microbiology

• Ángel Alegría, 
• Susana Delgado, 
• Clara Roces, 
• Belén López, 
• Baltasar Mayo

Realizado por:

Jose Miguel Crespo; Julieta G. Hamzé; Álvaro Herrero; Lara Romo