Zymomonas mobilis. Imagen insertada por el profesor. Fuente: EJBiotech
Autores
Takeshi
Hayashi, Yoshifumi Furuta y Kensuke Furukawa
Introducción
Zymomonas
mobilis es una bacteria Gram-negativa anaerobia facultativa que
puede fermentar determinados azúcares a través de una ruta
metabólica productora de bioetanol, en ocasiones, con mayor eficacia
que las levaduras. Posee un ciclo de Krebs incompleto, carente de
genes para 2 enzimas, pero posee unas características muy fuertes
para realizar las vías de síntesis de pirúvico a partir de glucosa
o gliceraldehído-3-fosfato. Este organismo también muestra una alta
tasa de captación de azúcares, fermentando a etanol estos tipos
específicos. Además, el rendimiento de síntesis de etanol como
combustible es del 97%, muy superior al 90-93% de Saccharomyces
cerevisiae.
Los
genes de Z. mobilis implicados en su respiración aún son un
misterio. Recientemente, se descubrió que el gen ndh (ZMO1113)
es el único encargado en las rutas del NADH y NADPH. Su ruta
metabólica es muy importante, ya que nos puede proporcionar claves
para mejorar la producción de etanol.
Las
cepas mutantes con deficiencias respiratorias, o RDM, son mucho más
evidentes en las levaduras ya que poseen una mayor tasa de
fermentación y un mayor rendimiento en la producción de etanol.
Estas cepas mutantes aparecen de forma espontánea o mediante la
exposición de agentes químicos como acriflavina. Sin embargo, en Z.
mobilis aún no se ha descubierto la forma de inducir este tipo
de mutación, aunque sí se han obtenido de forma artificial.
La
fermentación a temperaturas altas reduce los costes de refrigeración
y evita la contaminación por microorganismos mesófilos. Así, las
cepas termo-tolerantes de Z. mobilis podrían ser beneficiosas
para la fermentación de etanol a altas temperaturas. Una de tales
cepas, TISTR 405, muestra una actividad de alto crecimiento y
fermentación de etanol a 39 °C.
Materiales
y métodos
Cepas
y medios de cultivo
La
especie Z. mobilis ZM6 (ATCC 29191) se utilizó al igual que la cepa
silvestre y de ella se obtuvieron varias cepas RDM. El crecimiento
celular y la producción de etanol se examinaron utilizando un medio
que contiene 0,5% de extracto de levadura y 2% de glucosa; para medio
sólido, 1,5% de agar. Antibióticos, tales como sulfato de
estreptomicina (Sm), sulfato de gentamicina (Gm) y la rifampicina
(RIF) y monosulfato de kanamicina (Km).
Aislamiento
de cepas de RDM
Los
mutantes resistentes a los antibióticos fueron aislados de la cepa
de Z. mobilis silvestre ZM6. La cepa silvestre en fase
estacionaria se inoculó en el medio líquido y 100 l se extendieron
sobre los medios sólidos que contenian diversos antibióticos. Las
concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de la cepa silvestre en
medios líquidos y en medios sólidos fueron los siguientes: Rif, 10
mg / ml y 5 mg / ml; Sm, 300 mg / ml y 150 mg / ml; Gm, 15 g / ml y
10 mg / ml; Km, 30 mg / ml y 5 mg / ml, respectivamente. Las cepas
resistentes aisladas fueron repetidamente y rutinariamente cultivadas
en medios líquidos y sólidos con concentraciones aumentadas de los
respectivos antibióticos para obtener mutantes con mayor
resistencia. Además, dobles mutantes resistentes a los antibióticos
tales como Sm / Km, Sm / Rif, Sm / Gm, Rif / Km, y Rif / Gm también
fueron aislados en medios líquidos y sólidos. Las cepas mutantes se
cultivaron durante toda una noche en el medio líquido sin
antibióticos, y entonces 100 l de cada cultivo se extendió sobre
tres tipos de medios sólidos que contienen etanol y glucosa [4% (v /
v) ethanol/16% (w / v) glucosa, 5% / 16%, y% 5/14%, respectivamente].
Los medios sólidos se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente
hasta que aparecieron las colonias.
Cultivo
aeróbico y anaeróbica de cepas RDM
Se
realizaron cultivos anaeróbicos (3 ml) sin agitación en tubos de
ensayo a 30 ° C y 39 ° C (temperatura alta). Los cultivos aeróbicos
se llevaron a cabo de la misma manera, pero estos se agitaron a 220
rpm. Los resultados obtenidos aquí se expresan como las medias de al
menos tres experimentos. Se hicieron baños aeróbicos con los
cultivos con un volumen de 2 litros trabajando en un fermentador de
jarra de 5 litros con 300 rpm de agitación a 30 ° C, el oxígeno
disuelto (DO) se controló continuamente. Cultivos de una noche se
inocularon para su uso en todos los experimentos de crecimiento. El
crecimiento celular se monitorizó mediante densidad óptica a 660
nm.
Los
métodos de análisis
pO2
(saturación de oxígeno disuelto tanto por ciento) se midió
mediante un electrodo de oxígeno de tipo galvánico. Se
centrifugaron cultivos de una noche (100 ml) y se lavaron en tampón
fosfato 10 mM (pH 6,9). A continuación, las células se
resuspendieron en 1 L de la misma solución tampón y luego se
transfirieron al fermentador de jarra de 5-L . El consumo de oxígeno
de las células se midió utilizando un electrodo de oxígeno después
de la adición de 2% de glucosa a 30 ° C. La concentración celular
se determinó como DO 660, y la masa celular seca se calculó por
referencia a una curva de calibración.
La
concentración de etanol se determinó por cromatografía de gas. La
columna era una columna en espiral (2 m por 3 mm de diámetro
interno) rellena con un Q Porapak, y se utiliza a 155 °C. La
concentración de etanol se calculó por referencia a una curva de
calibración.
Preparación
de ARN total
Los
ARN totales para los experimentos de microarrays de ADN se extrajeron
de los cultivos agitados de cepas silvestres y cepas RDM-4 cultivadas
a 30 ° C, un cultivo anaeróbico de la cepa silvestre crecida a 30 °
C, y un cultivo anaeróbico de RDM-4 crecido a 38 ° C. Debido al
bajo rendimiento de ARN total extraído a 39 ° C, la condición de
alta temperatura se adoptó como 38 ° C. Las células se cultivaron
hasta la fase logarítmica tardía y se trató inmediatamente con el
reactivo de RNAprotect bacteriana para la estabilización de ARN. El
ARN total se extrajo con un kit RNeasy Midi y se concentró con un
RNeasy mini kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
ARN extraído se cuantificó espectrofotométricamente.
Experimentos
de microarrays de ADN
Los
experimentos de expresión génica utilizando microarrays de ADN se
realizaron por NimbleGen Systems, Inc.. En resumen, la matriz de todo
el genoma de Z. mobilis se diseñó a partir de la fase de
lectura abierta (ORF) de la cepa Z. mobilis ZM4.
Los arrays se componen de sondas
de oligonucleótidos 60-mer con dos repeticiones y 18 sondas
únicas por gen (es decir, un total de 36 sondas por gen). El ARN
extraído fue probado para la pureza y la integridad, y luego
etiquetado con Cy3; la hibridación de microarrays, la adquisición
de datos, y la normalización se llevó a cabo por NimbleGen.
Microarray
datos de número de entrada
Reacción
en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)
Los
cebadores se diseñaron utilizando Primer-3 software. Las muestras de
ARN almacenadas a -80°C (las mismas muestras utilizadas para los
experimentos de microarrays de ADN) se utilizaron para la qPCR. La
PCR transcriptasa inversa (RTPCR) se realizó usando el One-step qPCR
kit, con la siguiente composición: el volumen de reacción total fue
de 20 μl de los que 10 μl son de ARN-direct SYBR Green PCR Master
Mix en tiempo real, 0,2 mM de cada cebador, 50 mM de Mn (OAc)2, y 20
pmol de ARN total como plantilla. La RT-PCR, incluyendo los pasos de
la transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), se llevó a cabo usando una ADN polimerasa. Las mezclas fueron
primero desnaturalizadas a 95 ° C durante 30 s, y luego se llevó a
cabo la RT a 61 ° C durante 20 min. El ciclo de PCR se realizó en
55 ciclos a 95 º C durante 5s, 55 º C durante 10 s, y 74 ° C
durante 15 s. Las reacciones se realizaron en un instrumento
Light-Cycler de PCR.
Ensayo
de la concentración intracelular de peróxido de Hidrógeno
Las
células cultivadas hasta la fase logarítmica tardía se recogieron
y se lisaron por sonicación. El nivel de peróxido de hidrógeno
intracelular se determinó mediante la oxidación de ión ferroso en
la presencia de un indicador de ión férrico, naranja de xilenol.
Cincuenta litros de extracto celular bruto se añadió a 950 litros
de reactivo FOX [100 mM naranja de xilenol (Sigma), sulfato de amonio
250 mM ferroso, 100 mM de sorbitol y 25 mM de ácido sulfúrico]. La
mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min y luego se
centrifugó para eliminar cualquier material floculado antes de medir
la OD560. La concentración de peróxido de hidrógeno se representa
con nanomol por miligramo de proteína.
Resultados
Aislamiento
de colonias mutantes con una alta capacidad de fermentación
alcohólica bajo condiciones aeróbicas
Las
colonias mutantes que poseían una alta capacidad fermentativa
alcohólica fueron aisladas y diferenciadas mediante una técnica de
cribado en mutantes altamente tolerantes a la glucosa y al alcohol y
en varios mutantes resistentes a antibióticos. De estos, la colonia
simple altamente resistente a antibióticos y la doble resistente a
antibióticos, tendían a mostrar una alta capacidad de formación de
colonias en el medio sólido con contenido en glucosa y etanol. Lo
sorprendente, es que estas mismas colonias no presentan una
tolerancia significante al etanol o la glucosa en comparación con el
genotipo silvestre, sino que estos mutantes exhiben una mayor
capacidad de producción de etanol bajo condiciones aeróbicas.
Crecimiento
y producción de etanol de las colonias mutantes bajo condiciones
aerobias y anaerobias
Las
colonias más importantes fueron aisladas para mayor investigación,
siendo sometidas a condiciones de aerobiosis y
anaerobiosis para estudiar su producción de etanol.
Bajo
condiciones anaerobias, las colonias mutantes presentaban una
producción y un crecimiento similar a las colonias silvestres.
Por lo que podemos concluir que no existe diferencia remarcable entre
el crecimiento y la producción de etanol bajo condiciones de
anaerobiosis entre colonias mutantes y silvestres.
En
cambio, podemos observar que las colonias alcanzan un crecimiento
máximo en condiciones aerobias. Concretamente, las colonias RDM-4 y
RDM-8 mostraban el mayor crecimiento y productividad en medio
aeróbico.
Consumo
de oxígeno de las colonias mutantes
La
evaluación de la respiración se llevó a cabo en un frasco
fermentador ligado a un electrodo de Oxígeno disuelto. Todas las
colonias mutantes estudiadas presentaron un consumo de oxígeno menor
que las colonias silvestres, es decir,
mostraron una diferencia respiratoria, por lo que son designadas como
rdm. En concreto las RDM-4 y RDM-8 mostraron un consumo de
oxígeno extremadamente bajo, de alrededor del 20-30% menos que las
silvestres.
Crecimiento
y producción de etanol de las colonias RDM bajo condiciones
aeróbicas y anaeróbicas a alta temperatura
Bajo
condiciones de estrés, se observó que las colonias RDM
incrementaban su termotolerancia. Las colonias silvestres crecían a
temperaturas de 39ºC, sinembargo, su productividad alcohólica
decrecía a esa temperatura. Mientras tanto, todas las cepas RDM
mostraron un crecimiento alto y alta producción de etanol, incluso a
39°C, bajo ambas condiciones: anaeróbicas y aeróbicas. Entre
ellas, la cepa RDM-4 presentó el mayor índice de crecimiento y
productividad.
Es
conocido el efecto que tiene el acetaldehído en la inhibición del
crecimiento y productividad en el crecimiento aeróbico de Z.mobilis.
Sin embargo, este compuesto no fue detectado en ningún cultivo.
Análisis
de microarrays ADN de capacidad de fermentación alta en condiciones
aeróbicas y termotolerancia de RDM-4
Para
investigar cómo las cepas RDM exhiben mayor fermentación de etanol
bajo condiciones aeróbicas, se hizo el análisis de microarrays de
ADN de la colonia RDM-4: este mutante mostró la mayor deficiencia
respiratoria, aun así crece bien a 39 ° C y su producción de
etanol es buena en cualquier condición.
La
expresión de genes con ARN de las células cultivadas a 30 ° C bajo
condiciones de crecimiento aeróbicas se comparó entre los de tipo
silvestre y cepas RDM-4 cepas. De ello se concluyó que quince genes
fueron transcritos de forma diferente. De ellos, tres estaban
relacionados con la biosíntesis de cisteína (metE, cysK y cysD).
La
especie Z. mobilis fermenta la glucosa a etanol a través de 3
vías diferentes en los que participan un total de 13 genes. La
expresión de estos genes se comparó entre las colonias silvestres y
las RDM-4 cultivadas a 30ºC, y la conclusión fue que los 13 genes
examinados mostraron mayor expresión en RDM-4 que en la cepa
silvestre.
Para
confirmar la conclusión del análisis de microarrays se realizó una
qPCR para los 13 genes. Los resultados confirmaron que la expresión
de los 13 genes es mayor en RDM-4 que en la cepa de tipo silvestre
bajo condiciones de crecimiento aeróbicas.
Para
examinar el mecanismo de la termotolerancia de cepas RDM, se comparó
la expresión de genes en anaerobiosis de la colonia
RDM-4 cultivada a alta temperatura y la cepa de tipo silvestre
cultivada a la temperatura óptima (30 ° C) bajo condiciones
anaeróbicas: un total de 103 genes mostraron cambios significativos.
En
el genoma de Z. mobilis ZM4, hay ocho proteínas de choque
térmico (HSPs). Estos HSPs no fueron significativamente inducidos
por estrés térmico, excepto en uno de ellos. Eso se debe a que los
microorganismos poseen ciertos genes para protegerse contra el estrés
oxidativo, que incluyen genes antioxidantes que codifican la
superóxido dismutasa, la catalasa, la tiorredoxina, y la
glutarredoxina.
Además,
los genes de reparación del ADN también son inducidos por el estrés
oxidativo. Sin embargo, nueve genes antioxidantes y 17 genes de
reparación del ADN en Z. mobilis no mostraron alteraciones
significativas en la respuesta al estrés por calor, a excepción de
2 genes de reparación.
Nivel
de peróxido de hidrógeno intracelular de las cepas RDM bajo
condiciones de alta temperatura
Los
diversos estudios de S. cerevisiae sugirieron que el estrés
por calor provoca estrés oxidativo, que es un factor de estrés
importante bajo condiciones de alta temperatura.
Para
estimar el mecanismo de termotolerancia de cepas RDM, se midieron los
niveles intracelulares de peróxido de hidrógeno de cepas RDM bajo
condiciones de alta temperatura. RDM-4 y RDM-8 mostraron niveles
significativamente reducidos de peróxido de hidrógeno intracelular.
Estos
resultados indican que las cepas RDM, en particular, RDM-4 y RDM-8
sufren estrés oxidativo mucho más bajo que la cepa de tipo
silvestre bajo condiciones de alta temperatura.
Conclusiones
Por
estos resultados, se ha considerado que la reducción de estrés
oxidativo intracelular y la reducción de la acumulación de
acetaldehído en las variedades de RMD, produce un aumento en el
crecimiento y en la energía que fluye de glucosa a etanol bajo
condiciones aeróbicas. El grado de deficiencia respiratoria refleja
el crecimiento y fermentación alcohólica, particularmente a altas
temperaturas. Adicionalmente, la termotolerancia en las variedades
RMD es resultado del estrés oxidativo. Los esfuerzos del equipo
científico se centran en la caracterización de los genes y
proteínas responsable de la generación de las variedades RMD en
Z.mobilis para su futura mejora.
