Efectos agudos de la tetraciclina y la eritromicina en mecanismo de almacenamiento de polihidroxialcanoatos

El almacenamiento de biopolímeros es ahora reconocido como un proceso auxiliar durante la utilización de sustratos de cultivos. Principalmente, este almacenamiento resulta de un desequilibrio entre la eliminación del sustrato disponible y el potencial de crecimiento microbiano. Mientras que el sustrato debe de ser eliminado, las limitaciones en las reacciones metabólicas que tienen como consecuencia el crecimiento, prevendrán el consumo total de energía y esto desencadenará la desviación de una fracción del sustrato para la generación de biopolímeros intracelulares.

El mecanismo de almacenamiento también es importante en el estudio de la inhibición de la biodegradación del sustrato bajo el impacto de los productos químicos nocivos. Tradicionalmente, la inhibición (de la degradación) se interpretaba por medio de la analogía de enzimas que afectan solamente al crecimiento microbiano, sin embargo se ignoraba el almacenamiento de sustrato. Posteriormente se descubrió que este era realmente importante, sobre todo bajo condiciones adversas, donde se producía una desviación del sustrato de crecimiento para el almacenamiento, y si se ignoraba esto se producía una interpretación errónea del impacto inhibitorio.

El objetivo de esta investigación fue estudiar los efectos de antibióticos como la tetraciclina y la eritromicina como compuestos inhibitorios (de la degradación del sustrato). Y se evaluó su impacto sobre la biodegradación de una mezcla de extracto de carne (peptona). En primer lugar se puso en marcha un reactor de cultivo secuencial con una biomasa tomada de una planta de tratamiento de aguas residuales doméstica.  Una vez aclimatada la biomasa, esta se utilizó para comenzar una serie de ejecuciones en batch, donde cada ejecución  incluía dos reactores batch en paralelo, uno para la evaluación de biopolímeros intracelulares, y el otro, para los perfiles de análisis respirométricos de la tasa de consumo de oxígeno (TCO).

La primera ejecución se desempeñó como el control; las otros dos ejecuciones incluyeron en condiciones de alimentación una dosis inicial de antibiótico de 50 mg/L y 200 mg/L por su agudo impacto principalmente en el almacenamiento de sustrato.

Tabla 1. Presenta los dos ciclos con tetraciclina (TET) y los otros dos con eritromicina (ERY), el primero es el control.

El almacenamiento de sustrato observado en el reactor de control operó sin dosificación de  antibiótico. El perfil de PHA observado exhibe un pico inicial, reflejando la acumulación de PHA; después, fue caracterizado por una curva descendente resultado de la consumición bioquímica del PHA almacenado como sustrato interno para el crecimiento microbiano. Los PHA almacenados fueron consumidos como sustrato interno y decrecieron hasta el nivel inicial en unas 20 horas.

Gráfica 1. Reactor control.

Cuando se adicionó tetraciclina se observó que esta infligió cambios significativos en el mecanismo de almacenamiento traducido por una forma modificada del perfil de PHA.  A una dosis de 50 mg/L, los niveles de PHA se incrementaron rápidamente y el incremento continuó aunque de forma más lenta hasta alcanzar una meseta en las primeras 4 h. Posteriormente, el perfil de PHA exhibió una leve disminución, lo que indica que su utilización como un sustrato interno fue bloqueado parcialmente debido a la acción inhibidora de la tetraciclina.

Gráfica 2. Reactor con tetraciclina con dosis de 50 mg/L.

Al aumentar la dosis de tetraciclina a 200 mg/L se redujo la acumulación de PHA total. Sin embargo, se redujo aún más la utilización interna de PHA almacenado. La dosis más alta de TET también parecía afectar al metabolismo de los componentes de almacenamiento individuales.

El impacto de la eritromicina en el mecanismo de almacenamiento fue diferente en comparación con la tetraciclina en el sentido de que una parte mucho más grande del sustrato inicialmente disponible para el crecimiento microbiano se desvió al almacenamiento. Al igual que en el efecto observado en la tetraciclina, la eritromicina ejerció una disminución en la utilización interna de productos de almacenamiento.

Gráfica 3. Reactor con eritromicina con dosis de 50 mg/L.

Al aumentar la dosis de eritromicina, el almacenamiento no se vio prácticamente afectado con respecto al experimento anterior. Sin embargo, la dosis más alta redujo aún más la tasa de utilización del PHA interno.

En los perfiles de TCO pudimos observar un descenso significativo en la cantidad de oxígeno consumido entre el reactor de control y los que operaron con dosificación de antibióticos, a pesar del hecho de que todos comenzaron con la misma concentración de sustrato. Esta diferencia de DQO se explica en término de inhibición acompetitiva  donde la fracción del sustrato disponible se mantenía ligado con el inhibidor, impidiendo su utilización. Por otra parte, la mejora en el almacenamiento es probable que sea uno de los factores más importantes que inducen un menor consumo de oxígeno.

Estos resultados nos sugirieron que la TCO es una herramienta esencial para entender el impacto de los antibióticos. Además, que las evaluaciones cinéticas y estequiométricas en los efectos  inhibitorios no deberían limitarse solo al crecimiento microbiano, sino que deben cubrir todos los procesos bioquímicos, incluyendo el almacenamiento de sustrato, donde es importante. Y que el observado decrecimiento en el nivel de oxígeno consumido bajo el agudo efecto de los antibióticos podría no ser solamente atribuido a la mejora en el almacenamiento sugiriendo un mecanismo de unión al sustrato adicional mediante antibióticos.

Bibliografía:

Tugce Katipoglu-Yazana, Ilke Pala-Ozkoka, Emine Ubay-Cokgor, Derin Orhona

Acute impact of tetracycline and erythromycin on the storage mechanism of polyhydroxyalkanoates

doi:10.1016/j.biortech.2013.06.121

Integrantes:

Jaime Caruana Santiago

Iván Ramón Trimiño

Álvaro Huguet López

Nicolás Torres Mantelet

Mirela Rúmenova Raychínova

Javier Guerrero Meca

Nuevas milbemicinas obtenidas a partir del mutante Streptomyces bingchenggensis X-4

Streptomyces bingchenggensis es una bacteria gram positiva de la clase actinobacterias, perteneciente al  género Streptomyces, responsable de procesos fermentativos de materia orgánica y de la producción de milbemicinas, antibióticos macrólidos (destacados en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias intracelulares) de 16 miembros con una actividad excepcional contra diversos tipos de ácaros. Los tipos conocidos de milbemicinas son alfa1 (A3), alfa3 (A4), beta14, beta28, beta29, alfa30 y ST 906, cuatro secomilbemicinas A, B, C y D, y dos milbemicinas pentapeptídicas. Para la elevada producción de los productos A3 y A4 se obtuvo una estirpe mutante fenotípicamente diferente a Streptomyces bingchenggensis, denominada S. bingchenggensis X-4, mediante procesos de tratamiento con rayos UV, N-metil-N-nitroso-N-nitrosoguanidina (agente químico mutagénico) y técnicas de manipulación genética.  Mientras se estaba realizando la investigación de los metabolitos producidos por esta nueva cepa, aparecieron tres nuevos compuestos bastante interesantes: la milbemicina beta15 (1), secomilbemicinas E (2) y F (3) los cuales se aislaron del caldo de fermentación de S. bingchenggensis X-4. La estructura del  compuesto 1 es similar a la milbemicina D, compuesto que  se usa como plaguicida contra nematodos (una especie de gusanos) parasitarios de las plantas, además es muy selectivo y bastante potente, por lo que la bioactividad del compuesto 1 debe de investigarse más.   Respecto a las secomilbemicinas previamente descubiertas, los grupos hidroxilo (OH) en el carbono situados en la posición 5,  no se encontraban en los compuestos 2 y 3. Otro dato importante es que las milbemicinas y avermectinas obtenidas a partir de microorganismos, contienen ese grupo hidroxilo en C-5 y los derivados de estas solo se pueden obtener mediante métodos sintéticos, por lo que estos dos nuevos compuestos, que no presentan ese grupo hidroxilo característico en el carbono 5, pueden tener un papel importante en la compresión y el perfeccionamiento de las vías de biosíntesis de milbemicinas.

Para la obtención de estos compuestos se llevo a cabo una sería de procesos. En primer lugar, la cepa mutante se mantuvo en un agar inclinado, que proporciona  un medio selectivo de bajo pH útil para cultivar organismos acidotolerantes (capaces de vivir y tolerar un pH acido) y acidófilos (crecimiento óptimo en pH de 1 a 5),  a una temperatura de 28ºC durante 12 días. Luego, este medio de cultivo se traslada a un matraz en un reactor rotatorio a 250 rpm (revoluciones por minuto) durante 30 horas a 28°C. Una vez finalizado este periodo de tiempo, se inocula con 0,5 L (provenientes del matraz) un fermentador con 10 L de medio de siembra y con  una capacidad máxima  de 15 L. En este fermentador se  incuba durante 32 horas con una aireación y agitación de 1VVM (vvm = volúmenes de aire por unidad de volumen de medio por minuto) y a 180 rpm.

Después de dicha incubación, se transfirieron 3 L de este fermentador de 15 L a otro fermentador de producción con  30 L de medio de cultivo y una capacidad máxima de 50 L. En este fermentador se mantuvo a 28 ºC, con un pH inicial de 7.4 y se esterilizó por burbujeo de vapor (mediante un sparger, que es el instrumento utilizado para suministrar vapor a presión al interior del fermentador) a 121ºC durante 30 min. Una vez esterilizado, se realizó la fermentación durante 10 días a 28 ºC. En todo el proceso siempre  se garantizó unas condiciones apropiadas para favorecer el proceso fermentativo.

  Sparger, instrumento utilizado para suministrar vapor a presión al fermentador. Se trata de una especia de tubo perforado conectado un pistón, de tal manera que el movimiento horizontal de dicho pistón provoca la entrada de vapor a presión en el interior del fermentador

Tras la incubación durante 10 días, el caldo de fermentación (33 L) se filtró. La torta (los restos obtenidos tras la filtración) resultante fue lavada con agua, y ambos, el  filtrado y el lavado, se descartaron, ya que lo único que  interesa es la torta, donde se encuentra los productos de interés. El metanol (10 L) se utilizó para extraer la torta lavada. Alrededor de 2 L del extracto de metanol (MeOH) fueron evaporados a presión reducida y a 45 ºC , y el concentrado resultante se extrajo tres veces usando un mismo volumen de EtOAc (etanoato de etilo). Posteriormente,  la fase de EtOAc combinada se concentró bajo presión para rendir 30 g de sustancias oleosas, con las que se realizó una cromatografía sobre un gel de sílice. Después se eluyó con petróleo y éter-acetona y se obtuvieron dos fracciones, la fracción I y II. A la fracción I se le sometió a una columna de Sephadex LH-20 (lecho usado para algunos tipos de cromatografía por donde pasan o no las muestras a estudiar) en gel,  eluyendo con MeOH para así tener la subfracción I, la cual se depuró a partir de una HPLC (cromatografía liquida de altaeficacia) para así obtener un compuesto puro a temperatura ambiente.

En la fracción II se procedió de la misma manera, es decir, se realizó una cromatografía en columna de Sephadex LH-20 eluyendo también con MeOH para obtener así la subfracción II. Esta se purificó con una HPLC semipreparativa  utilizando un disolvente (contiene una mezcla de CH₃OH-CH₃CN-H₂O) para obtener así un compuesto puro a temperatura ambiente, en este caso la milbemicina β₁₅.

Una vez que se realizó la purificación y concentración de los compuestos, el compuesto 1 se aisló como un aceite incoloro con UV y se estableció su fórmula molecular, siendo esta C₃₃H₅₀O₇ que se deduce mediante una ionización de alta resolución por electrospray (HRESI)

También se realizó una RMN (resonancia magnética nuclear) para descubrir la estructura de cada compuesto, y esta técnica consiste en aplicar un campo magnético externo que va a provocar que los núcleos de los átomos a analizar se orienten en la misma dirección que el campo magnético externo. La radiofrecuencia utilizada para excitar estos núcleos nos va a dar un espectro de emisión de estos núcleos, que liberarán esta energía cuando se deje de inducir el pulso de radiofrecuencia y los núcleos reorienten su campo magnético local a su posición inicial.

  Estructura de la milbemicina β15 obtenida por RMN 

De esta forma se ha logrado extraer milbemicinas por procesos fermentativos de una estirpe mutante de Streptomyces bingchenggensis, que han adquirido una gran importancia biotecnológica  ya que, actualmente,  se utilizan como acaricidas frente a ácaros adultos de Tetranychus urticae y como nematocida contra Caenorhabditis elegans.

Integrantes del grupo:

Ricardo Requena Platek

Guillermo del Barco Aldaz

Manuel Garrido Romero

Rubén Mollá Albaladejo

Joan Sánchez Pascual

Referencias bibliográficas:

"New milbemycins from mutant Streptomyces bingchenggensis X-4"

The Journal of Antibiotics (2011) 64, 753–756; published online 17 August 2011

Bao-Xin Zhang, Hui Zhang, Xiang-Jing Wang, Ji-Dong Wang, Chong-Xi Liu and Wen-Sheng Xiang

http://www.nature.com/ja/journal/v64/n11/full/ja201175a.html

Producción de nuevos antibióticos lipopeptídicos

Los antibióticos son compuestos producidos por bacterias, hongos u otros eucariotas que  pueden destruir microorganismos susceptibles o inhibir su crecimiento, adquiriendo gran interés para el tratamiento de enfermedades.

Se pueden clasificar según su forma de obtención, espectro de acción, modo de acción y  estructura química,que puede ser muy diversa, lo que les permite interaccionar con diferentes partes de la bacteria.

Centrándonos en la estructura química, cabe destacar  los lipopéptidos cíclicos que emergen como alternativa mejorada frente a los antibacterianos existentes, abarcando mayor rango de efectividad al solucionar el problema de las resistencias a estos últimos.Debido a  su reciente aparición, no han brotado reacciones de hipersensibilidad, de manera que ofrecen una vía de investigación para su desarrollo y comercialización. Esto es de interés ya que  actualmente es la Daptomicina el único antibiótico lipopéptido accesible para el uso en humanos.

Fármaco encuya composición entra Daptomicina

La Daptomicina es empleada para tratar infecciones complicadas de la piel y tejidos blandos, endocarditis infecciosa del lado derecho, así como bacteriemia causadas por bacterias Gram- positivas.

Este antibiótico se une a la membrana generando una despolarización que desencadena la rápida inhibición de la síntesis de ADN, ARN y proteínas al generar poros por la formación de micelas; de esta manera una “lisis celular insignificante” conduce irreversiblemente a la muerte del patógeno.

Streptomyces fradiae

No obstante, este antibiótico es inactivado por el surfactante pulmonar por lo que para tratar una enfermedad como la neumonía común adquirida es ineficaz. Para solventar este inconveniente, se procede a realizar numerosas modificaciones a la daptomicina para dar compuestos de eficaz actividad antibacteriana en presencia de surfactante; los compuestos no fueron lo suficientemente activos como para ser extendidos a estudios clínicos. De modo que, tomando como referencia la Daptomicina, se ha empezado a trabajar con estructuras similares como es el caso del lipopéptido A54145, sintetizado por el microorganismo Streptomyces fradiae.

Figura 1: Seobserva un anillo de diez aminoácidos y una cola de tres, difiriendo ambasestructuras en las cadenas hidrocarbonadas de los ácidos grasos.

A54145 presenta diferentes versiones que pueden ser modificadas por la adición de aminoácidos o lípidos al medio de crecimiento del microorganismo; lo que supone un método para obtener nuevos compuestos. Esto es de interés para estudiar la toxicidad y propiedades antibacterianas de las variantes de A54145 en ratones.

Ahora bien, dado el desarrollo de la Ingeniería Genética, los científicos no concentran su labor sólo en manipular el ambiente de la bacteria; sino que van más allá, proceden a modificar el genoma de la misma, es decir, aquella información que caracteriza al microbio y lo diferencia del resto. De esta manera, se dirige lo que produce la bacteria, obteniéndose nuevos compuestos de diferentes propiedades que se pueden analizar.

Cabe mencionar, que cuando los científicos controlan la expresión de esa información, desconocen lo que puede comportar ese cambio; se sabe que incide sobre sitios (aminoácidos) específicos del compuesto, pero no qué fracción de esa información es responsable de cada cambio.Es la necesidad que se presenta de correlacionar esas modificaciones  la que motiva a los investigadores a emprender la labor de elucidar la función de los genes-denominados “genes lpt” más concretamente-, con el fin de poder predecir las características del microorganismo con el que se está trabajando-generalmente denominadas “cepas”-.

Así pues, se obtienen cepas productoras de diferentes lipopéptidos; se comparan cualitativa y cuantitativamente por medio de herramientas como la espectrometría de masas o el análisis bioinformático.

Tabla 1:Actividad antibacteriana de los lipopéptidos.

Finalmente, se pone a prueba la actividad antibacteriana de los derivados de A54145 en presencia y ausencia de surfactante bovino, para valorar las Concentraciones mínimas inhibitorias(CMI); donde cabe destacar la baja y regular CMI del compuesto CB-182,390.

Ahora bien, el anterior compuesto dista mucho de la importancia clínica de la daptomicina; si bien, comporta una vía de investigación para suplir las necesidad de crear nuevos antibióticos. El fin de dar con buena actividad antibacteriana y nula toxicidad fundamenta las modificaciones oportunas para finalmente examinar las CMI de los productos obtenidos.

Bibliografía:

 Alexander DC1, Rock J, Gu JQ, Mascio C, Chu M, Brian P, Baltz RH.

Production of novel lipopeptide antibiotics related to A54145 by Streptomyces fradiae mutants blocked in biosynthesis of modified amino acids and assignment of lptJ, lptK and lptL gene functions. 24 November 2010. doi: 10.1038/ja.2010.138.

Jared A. Silverman, Lawrence I. Mortin, Andrew D. G. VanPraagh, Tongchuan Li and Jeff Alder.

Inhibition of Daptomycin by Pulmonary Surfactant: In Vitro Modeling and Clinical Impact.  7 March 2004. doi: 10.1086/430352.

Trabajo realizado por: Gemma Aparicio Lluch, Claudia Pérez García, Marisa Sidi Mohamed y Antonio Valenzuela Miralles.

Thuggacin, nuevo macrólido antibacteriano de Sorangium cellulosum que actúa contra bacterias grampositivas.

Recientemente se ha descubierto un nuevo tipo de antibiótico de la clase de los macrólidos al que se ha llamado thuggacin. Este antibiótico es producido por el microorganismo Sorangium cellulosum. Hasta la fecha se han identificado tres subtipos: thuggacin A, thuggacin B y thuggacin C que son efectivas contra bacterias grampositivas, especialmente del género Mycobacterium (entre ellos Mycobacterium tuberculosis, agente causante de la tuberculosis).
Se están investigando los tipos de thuggacin para su uso en la medicina. Actualmente también se está tratando de descubrir si existen otros compuestos derivados, así como su producción y su uso farmacéutico.

La cepa productora del antibiótico fue aislada desde una muestra de tierra en 1993. En primer lugar se realizó una fermentación a partir de dicha cepa y después con lo que se obtuvo se aislaron los thuggacin A y B. El tipo C solo pudo obtenerse por métodos químicos a partir del A y el B o bien por otro método de aislamiento diferente al anterior. 

La fermentación para la producción de thuggacin A se desarrolló de la siguiente manera:

Crecimiento del cultivo de Sorangium cellulosum

- Inoculación → Día 0

- Fase de latencia →  Días 1 y 2:

 No varía la concentración de almidón

- Fase exponencial → Días 3 a 5:

El día 4 el almidón se agota rápidamente

El día 5 empieza la producción de thuggacin.

- Fase estacionaria → A partir del día 5:

El día 6 se agota la glucosa.

El día 7 se alcanza la máxima concentración de thunggacin A (21 µg/ml).

Los días 8 a 12 el nivel de thunggacin A permanece constante.

A continuación se vio como afectaba el antibiótico aislado sobre otro microorganismo (Micrococcus luteus) mediante el uso de marcadores radiactivos los cuales se incorparaban en ácidos nucleicos y proteínas lo que permitió seguir su síntesis. Se obtuvo la siguiente gráfica en la que se aprecia como dicha síntesis se para por completo al añadir thuggacin. 

También se estudió su efecto sobre la cadena respiratoria, para lo cual fue necesario aislar las membranas de Micrococcus luteus y comparar las diferencias en presencia y ausencia de thuggacin. 

Los resultados de la medición del consumo de oxígeno de Micrococus luteus bajo la influencia de thuggacin están representados en la figura 4. Ésta muestra que la respiración fue inhibida al 100% con 2.5 ng/ml. La máxima inhibición de la oxidación de NADH (necesario para la cadena respiratoria) alcanzó el 90% a los 10 ng/ml de thuggacin A. Se utilizó como control KCN (inhibidor conocido de la cadena respiratoria) y se observó un máximo de inhibición con 60 µg/ml que alcanzó también el 90%.

El citocromo c reducido, tuvo una inhibición similar a la inhibición de la oxidación. La figura 4 también muestra la actividad de la citocromo oxidasa utilizando NADH.

La figura 5 muestra un espectro de absorción en el que la bajada de los picos se corresponde con la inhibición de la reducción de los distintos tipos de citocromo por la influencia de thuggacin A. De acuerdo a esto se observa que produce una inhibición parcial de la reducción de citocromo a (600.9 nm), citocromo b (560.3 nm) y citocromo c (551.7 nm). Un resultado similar se obtiene con KCN.

Se utilizaron también membranas citoplasmáticas de Mycobacterium phlei, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Staphylococcus auresus Bacillus subtilis. De ellas sólo las cadenas respiratorias de M. phlei y C. glutamicum mostraron una sensibilidad similar a M. luteus por thuggacin A. El resto de bacterias presentaban resistencia debido a una cadena respiratoria mucho más activa.

Se ha visto que thuggacin actúa sobre las  etapas finales de la cadena de transporte electronico en las bacterias donde tiene actividad. La inhibición de los citocromos producida por KCN y thuggacin es diferente debido a que cada uno se une a la proteína en una región distinta (distinto sitio de unión). El mecanismo de inhibición de la reducción de todos los citocromos no es aun conocida.

Efectos biológicos de thuggacin

Thuggacin inhibía el crecimiento de algunas bacterias gram-positivas, especialmente de Micrococus luteus y de especies del género Corynebacterium y Mycobacterium. Pero la gran diferencia observada entre estos generos eran los valores de MIC (concentración mínima inhibitoria) representados en la tabla 1. Las actividades de Thuggacins A y B fueron parecidas, pero la de thuggacin C presentó mucha menos actividad. No fueron activas contra levaduras y otros hongos. Se obtuvo un dato curioso: la línea celular de fibroblastos del ratón (células de mamífero) fue algo sensible a la thuggacin A (Tabla 1), por lo que podría tener efectos secundarios sobre células animales.

OTROS RECURSOS UTILIZADOS

• Artículo original:

Herbert Irschik, Hans Reichenbach, Gerhard Höfle, Rolf Jansen.

The Thuggacins, Novel Antibacterial Macrolides from Sorangium cellulosum 

Acting against Selected Grampositive Bacteria.

THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS.

 Received: August 16, 2007 / Accepted: November 28, 2007

© Japan Antibiotics Research Association

• Patentes del antibiótico:    

Patente estadounidense:   Rolf Jansen, Brigitte Kunze, Herbert Irschik - US8114864 B2
Patente europea:              Rolf Jansen, Brigitte Kunze, Herbert Irschik - EP2089025 B1

AUTORES DE LA ENTRADA:

• Adrián Guerrero Moreno
• Adrián Hernandez García
• José David Celdrán López
• Abraham Muñiz Chicharro 
• Maria José Verdú Polvorinos