Actualmente se está experimentando una creciente demanda energética. La
utilización de combustibles fósiles para suplir las necesidades energéticas conlleva
una serie de consecuencias perjudiciales; como puede ser el incremento de CO2
emitido a la atmósfera (resultado de la combustión de dichos combustibles) o la
lluvia ácida. Es por ello que la utilización de biocombustibles como el etanol resulta una
fuente de energía alternativa que es cada vez más prometedora. Concretamente,
la biomasa
celulósica presenta un bajo coste de producción y es muy abundante. A
partir de la hidrólisis de la biomasa celulósica se obtienen tanto hexosas como
pentosas, entre otros azúcares, que pueden ser transformados en biocombustibles como el etanol, mediante la
actuación de microorganismos fermentadores.
Aunque existen microorganismos etanogénicos, estos se ven limitados por
su capacidad para utilizar pentosas como sustratos (constituyendo estas el 90%
del total de biomasa celulósica). Es decir, son homoproductoras de etanol (no
producen ningún otro producto final), pero son incapaces de utilizar la fuente
de monómeros más importante en la biomasa celulósica; las pentosas.
Por otro lado, Escherichia coli,
aunque carece de la capacidad para producir etanol como único producto final,
sí presenta la habilidad de utilizar diversos tipos de azúcares como sustrato,
obteniendo rendimientos mayores de la biomasa celulósica. Además, es capaz de
asimilar con mayor velocidad el gluconato, presente en la
biomasa celulósica.
ESCHERICHIA COLI Y METABOLISMO
Con el objetivo aprovechar las ventajas que presenta Escherichia coli, el estudio se centra en el metabolismo de esta bacteria anerobia facultativa. Éste se puede dividir en dos fases principales; la degradación de los carbohidratos
para obtener piruvato y la degradación de éste (diferente en
condiciones aeróbicas y anaeróbicas).
Las diferencias
que supone la utilización del gluconato como fuente de carbono alternativa a la
glucosa derivan de su producción
energética en la via de Entner-Doudoroff, convirtiéndose en piruvato (menor
producción energética con respecto a la glucólisis). En condiciones anaeróbicas se producen 2
moles de ATP y dos de NADH por mol de glucosa para dar piruvato; mientras que
con gluconato solo se obtiene 1 mol de ATP y 1 mol de NADH. Para compensar esta
diferencia (pérdida) de ATP, las bacterias sintetizan más productos
oxidados como el acetato (que rinde ATP y NADH), produciendo lactato y etanol,
con el objetivo de controlar la concentración de NADH.
Una vez obtenido el piruvato, este puede degradarse a través de cuatro
rutas distintas, resumidas en el siguiente esquema:
 |
| Vías metabólicas por las que puede degradarse el piruvato (fermentaciones) |
Durante el estudio realizado por los investigadores, se aprovecha la capacidad de E. coli para metabolizar diferentes productos, realizando una serie de experimentos para determinar cómo es posible incrementar el rendimiento en la producción de etanol (y disminuir la de acetato y lactato).
MATERIALES Y MÉTODOS
Para los distintos experimentos se trabajó con la cepa E. coli K011, construida mediante la integración de la ruta de producción de etanol de Zymmonas mobilis (operón PET). E. coli K011 fue transformada para llevar a cabo los experimentos en diferentes cepas que se han obtenido a partir de esta. Para la obtención de dichas cepas se han noqueado distintos genes (codifican enzimas que participan en las rutas metabólicas fermentativas) por recombinación homóloga en diferentes combinaciones de estos genes noqueados. De este modo, se pudo estudiar qué efectos producen los genes modificados en el metabolismo de la bacteria: crecimiento, productos y rendimiento.
En los experimentos, el medio de
cultivo sobre el que se ha llevado a cabo las fermentaciones contiene medio LB
(Luria Bertani) y 2 % de glucosa, además del sustrato (glucosa o gluconato). El
pH fue ajustado a 6.5 y se consiguieron condiciones anaerobias. Las muestras fueron extraídas a distintos
intervalos de tiempo para determinar la concentración de los metabolitos y la
masa celular.
RESULTADOS
- Crecimiento:
- Crecimiento:
 |
| Velocidad de crecimiento máxima de E. coli K001 y las estirpes mutantes con glucosa o gluconato |
Cuando la glucosa es utilizada como fuente de carbono, todas las cepas
son capaces de producir la fermentación de dicho compuesto, dando lugar a etanol
como producto principal (más de un 100% del máximo teórico es alcanzado). Sin
embargo, E. coli K011 produce una
pequeña cantidad de acetato.
Utilizando gluconato como sustrato se pueden observar tendencias
similares en los mutantes a cuando se utiliza glucosa, aunque se aprecia que
todas las cepas que se estudiaron utilizaban el gluconato con mayor rapidez que
la glucosa, alcanzando velocidades de crecimiento mayores. El rendimiento de producción de etanol en E. coli K011 es de un 87.5% comparado con el rendimiento teórico
(sin embargo, el rendimiento de acetato aumentó hasta 117%).
- Producción de etanol:
El consumo de piruvato se
encuentra desviado hacia la producción de acetil-coA. La enzima PDH es inhibida por NADH en condiciones
anaerobias, pero la enzima LDH no requiere NADH para su funcionamiento. Por lo
tanto, las dos vías catalizadas por estas enzimas están reguladas por NADH y
evitarán la competición entre ellas. Sin embargo, la actividad de PDH no es
nula en condiciones anaerobias: funciona para mantener el equilibrio entre NADH
y NAD+.
Cuando se
usa glucosa, el ratio NADH/NAD+ es mayor porque la glucosa es un sustrato más reducido. Esto causa
que PDH quede inhibida y la producción de etanol aumente por la presencia de
NADH.
Al utilizar
gluconato como sustrato, la producción de acetato en general aumenta, ya que se
utiliza esta vía para compensar la pérdida de ATP con respecto a la utilización
de glucosa como sustrato. Además, se debe mantener un equilibrio entre NADH y NAD+, consumiéndose el exceso de NADH gracias a la formación de lactato y
etanol.
Teniendo estos
dos factores en cuenta, la estrategia utilizada para mejorar la producción de
etanol en E. coli K011 consiste en el noqueo de los genes pflA y ldh en conjunto. El noqueo de pflA hace que solo se pueda producir acetato y ATP a la vez que NADH
a través de la ruta catalizada por PDH. El exceso de NADH producido por esta
vía solo puede compensarse con la producción de etanol, ya que el gen ldh también está noqueado. Por lo tanto,
esta combinación es la óptima si se desea mejorar el rendimiento en la
producción de etanol.
CONCLUSIÓN
Aunque la
eliminación de rutas metabólicas competentes no produzca una mejora muy notable
de la producción de etanol cuando se utiliza glucosa como sustrato, sí que se
aprecian diferencias importantes utilizando gluconato.
En el experimento se consiguió aumentar el rendimiento de la producción de etanol a
partir de gluconato gracias a al noqueo de pfl
y ldh en conjunto. Sin embargo,
el noqueo de estos genes afectan moderadamente a la velocidad de crecimiento de
las bacterias, disminuyendo esta velocidad a un 70% de su valor en la cepa
silvestre (E. coli K011).
Amanda Hildebrand, Theresa Schlacta, Rebeccah Warmack,Takao Kasugab Zhiliang Fan, "Engineering Escherichia coli for improved ethanol production from gluconate", Journal of Biotechnology, 168 (2013) 101– 106.
*Las dos primeras imágenes han sido tomadas del artículo original
TRABAJO REALIZADO POR:
Samuel Daniel Lup, Esther Marhuenda Segarra, Adrián Martínez Tébar, Elisa Pérez Galiano y Marta Rubio Camacho
ARTÍCULO ORGINAL
Amanda Hildebrand, Theresa Schlacta, Rebeccah Warmack,Takao Kasugab Zhiliang Fan, "Engineering Escherichia coli for improved ethanol production from gluconate", Journal of Biotechnology, 168 (2013) 101– 106.
*Las dos primeras imágenes han sido tomadas del artículo original
TRABAJO REALIZADO POR:
Samuel Daniel Lup, Esther Marhuenda Segarra, Adrián Martínez Tébar, Elisa Pérez Galiano y Marta Rubio Camacho
