Adaptación de las bacterias lácticas al Butanol

ADAPTACIONES LÁCTICAS AL BUTANOL

Autores del trabajo:           

Ramón Quiles, Alfredo López, Isaac García, Rocío González, Javier Rivera.

INTRODUCCIÓN:

Debido a un suministro limitado y al aumento de la carga medioambiental dentro de la sociedad actual. La producción de combustibles a partir de materias primas renovables se ha convertido en un tema de prioridad mundial.

El Butanol ha sido reconocido como un buen candidato para cubrir este puesto, siendo un biocombustible superior, que producen algunos organismos como parte de su metabolismo y en un tiempo prudencialmente corto.

El butanol se produce, junto con acetona y etanol, por fermentación anaeróbica en el caso de bacterias Gram-positivas (particularmente especies del género Clostridium), dicha fermentación puede realizarse a partir de diferentes materias primas de origen agrícola.

Aún hoy existen diversas barreras que reducen la rentabilidad de la producción de Butanol, entre ellas encontramos la baja eficiencia fermentativa con materias primas baratas y alto grado de toxicidad del butanol para las colonias productoras del mismo. Por lo tanto, y a pesar de que necesitamos de una alta tasa de producción de butanol para rentabilizar el sistema, a mayor producción de butanol, menor desarrollo de las colonias productoras y un posterior decrecimiento de la misma producción. 

La tolerancia en las cepas microbianas empleadas no superaba el 2% de concentración de Butanol en el medio, cuando es necesaria una concentración algo mayor para comenzar a rentabilizar la producción del mismo. Esto ha llevado a varios investigadores a trabajar y estudiar otros organismos y encontrar uno que sea más tolerante que los hasta ahora empleados.

ESTUDIO

El objetivo del presente estudio fue evaluar la tolerancia a distintas concentraciones de butanol en el medio de una colección de bacterias lácticas aisladas de plantas de producción de etanol. Además, estas cepas fueron sometidas a una creciente concentración de butanol en los medios de cultivo para mejorar su tolerancia a esta sustancia. Aquí presentamos estos estudios para obtener y aislar cepas tolerantes al butanol.

1: Material y métodos 

• .  Se extrajeron diversas muestras de colonias bacterianas procedentes de plantas productoras de etanol.

1.2 . Para la identificación del fenotipo de interés (resistencia a concentraciones mayores de Butanol) se emplearon una serie de pruebas de origen comercial, y se comenzaron a aislar las diferentes colonias seleccionadas.

1.3 . Se llevó a cabo un proceso de adaptación-aclimatación muy lento bajo estrictas condiciones anaerobias. Los cultivos bacterianos fueron inoculados en la SRA. complementado con un 2%, 3% y 4% butanol y se incubaron a 37ºC en condiciones anaeróbicas. El crecimiento fue supervisado midiendo  la densidad óptica de cada cultivo. Los cultivos fueron transferidos al cultivo con un 2% y una vez que los cultivos demostraron crecimiento con un solo nivel de concentración de butanol (unos 68 cultivos), se comenzó el cambio a cultivos con un 3%. Después de 20 aclimataciones, los cultivos seleccionados fueron inoculados en la SRA. con 3 %butanol (prueba que solo pasaron 18 cultivos)… Y así hasta llegar al 4% de concentración.

1.4 . Las colonias más aptas para crecer en una concentración del 4% de butanol en el medio (unas 10) fueron seleccionadas y crecidas en un cultivo con esa concentración. Estos cultivos se mantuvieron con éxito durante una semana. Se realizaron 3 repeticiones y se pasó a analizar los resultados.

Análisis de Resultados

Una vez obtenidas las 10 cepas que superaron la prueba con el 4% de concentración en butanol, tuvieron que aplicar diversos métodos para averiguar a que especie pertenecían. Estos métodos fueron:

• El API 50 CH  que consta de 50 pocillos con una parte aerobia para la oxidación y/o asimilación de compuestos y otra anaerobia para la fermentación. A estos pocillos se les añaden  las bacterias a identificar y  diversos compuestos como azúcares en distintas proporciones (según el numero del pocillo). Dependiendo que compuestos finales se obtengan y que rutas metabólicas se utilicen, los cambios en el Ph, etc,  se puede identificar al microorganismo en cuestión.  

El otro método consiste en secuenciar un trozo del adn ribosomal de la bacteria para así poder asociarla a una especie en concreto.

Los organismos fueron identificados:

Los cultivos más tolerantes fueron el NE L 0206-31 y NE-L 0206-47 fueron identificadas por la API 50 CHL como pediococcus pediococcus parvulus y Lactobacillus crispatus, respectivamente. Los otros 8 aislamientos fueron identificados por 16 rDNA sequencing: NE-L 0206-19 fue identificada como Lactobacillus amylovorus, BR0216-18 como Weissella confused, y los seis cultivos restantes BR0605-3, BR0605-B15, BR0713-18, BR0713-20, BR0713-30, y BR0713-33 se identificaron como Lactobacillus mucosa.

Sólo cambiando las condiciones anaerobias pudimos identificar variedades tolerantes a altas concentraciones de Butanol. El hecho de que los rasgos tolerantes se encontraron en especies de lactobacilos sugirió que las variedades tolerantes pueden poseer las vías concretas para compensar el estrés generado por el butanol o singulares membranas/paredes celulares para proteger las estructuras de daño celular causado por el butanol. También es posible que determinadas señales se activen debido al estrés generado por la acción del butanol producioendo que la proteínas se coordinen para conferir cierta tolerancia al butanol.

¿Porqué eran más aptos estos organismos para soportar mayores concentraciones de Butanol?

Para comprobar si esta tolerancia se debía a una tolerancia determinada por sus genes o por otras razones, se escogieron las 5 cepas más tolerantes, tal y como las colectaron de las productoras de etanol y en un medio de cultivo se les inoculó un 4% de Butanol directamente.

Solo dos cepas soportaron este cambio obteniendo crecimiento a lo largo de 7 días, se trataba de dos cepas de Lactobacillus mucosae. Se obtuvo un crecimiento muy lento, pero a pesar de todo, apreciable, frente al resto de cepas, que tras 7 días no presentaron crecimiento alguno.

Durante este estudio de tolerancia se vio que el resto de cepas, con una adaptación más lenta, eran capaces de soportar esta concentración por una serie de mecanismos diversos, entre ellos un cambio en la composición de los ácidos grasos de membrana (con un consiguiente aumento de su fluidez). Era necesario conocer estos mecanismos para poder identificar los genes responsables de esta tolerancia a altas concentraciones de butanol y poder crear, por ingeniería genética microorganismos productores-tolerantes de Butanol. La idea era obtener Lactobacillum mucosae capaces de producir butanol, para conseguir un organismo que rentabilizase la producción de dicho combustible.

Fig. 1. Prueba de corto plazo el estrés butanol. Las cepas seleccionadas de las cepas originales de las plantas de etanol NE-L0206-19 (amylovorus Lactobacillus), BR0216-18 (Weis-turca confusa) y BR0315-B4 (Lactobacillus johnsonii) y BR0713-30 (mucosa Lactobacillus) , y BR0713-33 (mucosas Lactobacillus) se sembraron en placas de agar MRS y las colonias individuales se inocularon en caldo MRS suplementado con 4% butanol. Los cultivos se mantuvieron durante una semana y OD600 valores fueron graficados contra el tiempo whenOD600 lecturas fueron tomadas en el caldo de cultivo mismo. Tres experimentos se llevaron a cabo y los valores medios se presentaron.

VERSIÓN GRUPO ARA

ADAPTATIONS TO BUTANOL LÁCTIC

Authors of work: Ramón Quiles, Alfredo López, Isaac García, Rocío González, Javier Rivera.

Introduction:

Due to limited supply and increasing the environmental burden in the society. The production of fuels from renewable raw materials has become a priority issue worldwide.

Butanol has been recognized as a good candidate to fill this position, being a superior biofuel, produced by some organisms as part of their metabolism and in a short time prudently. The butanol is produced, along with acetone and ethanol by anaerobic fermentation in the case of Gram-positive bacteria (especially species of the genus Clostridium), said fermentation can be made from different raw materials of agricultural origin.

Even today there are several barriers that reduce the profitability of the production of butanol, among them we find the low efficiency with inexpensive raw materials fermentation and high toxicity of butanol for producing colonies of the same. Therefore, despite that need a high rate of production of butanol to recoup the system, increased production of butanol, lower development of the colonies producing and a subsequent decrease in the same production. Tolerance in microbial strains used did not exceed 2% concentration of butanol in the middle, when you need a somewhat higher concentration to start the production of it profitable. This has led some researchers to work and study other organizations and find one that is more tolerant than the hitherto employed.

STUDY

The aim of this study was to evaluate the tolerance to different concentrations of butanol in the middle of a collection of lactic acid bacteria isolated from ethanol production plants. Furthermore, these strains were subjected to an increasing concentration of butanol in the culture media for tolerance to it. We present these studies to obtain and isolate butanol tolerant strains.

1: Material and methods

1.1. Samples were extracted several bacterial colonies from ethanol-producing plants.

1.2. To identify the phenotype of interest (resistance to higher concentrations of butanol) were used a series of tests of commercial origin, and began to isolate the different colonies selected.

1.3. He took out a process of slow adaptation, acclimatization under strict anaerobic conditions. Bacterial cultures were inoculated in MRS. supplemented with 2%, 3% and 4% butanol and incubated at 37 ° C under anaerobic conditions. Growth was monitored by measuring the optical density of each culture. The cultures were transferred to culture with 2% and once with growth cultures showed a single level of concentration of butanol (about 68 cultures), began to change crops with 3%. After 20 acclimatizations, selected cultivars were inoculated in MRS. with 3% butanol (test only took 18 crops) ... And so on up to 4% concentration.

1.4. Colonies more apt to grow at a concentration of 4% of butanol in the medium (about 10) were selected and grown in culture with this concentration. These cultures were successfully maintained for one week. There were 3 replications and went on to analyze the results.

ANALYSIS OF RESULTS

After obtaining the 10 stocks that passed the test with 4% butanol concentration had to use various means to find out which species they belonged. 

These methods were:       

• The API 50 CH consisting of 50 wells with an aerobic part for oxidation and / or assimilation of compounds and other anaerobic for fermentation. These wells are added to identify bacteria and various compounds such as sugars in various proportions (based on the number of wells). Depending on which final compounds are obtained and that metabolic pathways are used, changes in pH, etc., can identify the organism in question.

• The other method is to sequence a piece of the ribosomal DNA of the bacteria in order to associate a particular species.

The organisms were identified:

The cultures were more tolerant NE and NE-L 0206-31 L 0206-47 were identified by the API 50 CHL as Pediococcus Pediococcus parvulus and Lactobacillus crispatus, respectively. The other 8 isolates were identified by 16 rDNA sequencing: NE-L 0206-19 was identified as Lactobacillus amylovorus, BR0216-18 as Weissella confused, and the six remaining crops-3 BR0605, BR0605-B15-18 BR0713, BR0713-20 , BR0713-30, and BR0713-33 were identified as Lactobacillus mucosa.Only by changing the anaerobic conditions we could identify varieties tolerant to high concentrations of butanol. The fact that the tolerant features were found in species of lactobacilli tolerant varieties suggested that may possess the specific means for compensating the stress generated by the butanol or unique membranes / cell walls to protect the structures of cellular damage caused by butanol. It is also possible that certain signals are activated due to stress generated by the action of butanol producioendo that the proteins are coordinated to confer some tolerance to butanol.

Why these organisms were more apt to withstand higher concentrations of butanol?

To check whether this tolerance was determined by a tolerance genes or for other reasons, the 5 strains were chosen more tolerant as those collected from the ethanol and producing in a culture medium were inoculated with 4% butanol directly. Only two strains endured this change getting growth over 7 days, there were two strains of Lactobacillus mucosae. It was a very slow growth, but nevertheless significant, compared to other strains, after 7 days did not grow at all. During this tolerance study was that the remaining strains, with a slower adaptation, were able to withstand this concentration for a number of different mechanisms, including a change in composition of fatty acids from membrane (with a consequent increase of fluency). It was necessary to understand these mechanisms to identify the genes responsible for this tolerance to high concentrations of butanol and to create genetically engineered microorganisms producing butanol-tolerant.

Figure 1. Short-term test butanol stress. Selected strains of the original strains of ethanol plants NE-L0206-19 (Lactobacillus amylovorus), BR0216-18 (Weis-Turkish confusing) and BR0315-B4 (Lactobacillus johnsonii) and BR0713-30 (Lactobacillus mucosa), and BR0713 -33 (mucous Lactobacillus) were plated onto MRS agar and individual colonies were inoculated in MRS broth supplemented with 4% butanol. Cultures were maintained for a week and OD600 values ​​were plotted against time whenOD600 readings were taken at the same broth. Three experiments were conducted and mean values ​​were presented.

Bacteriocinas en el queso

PRODUCTORES DE BACTERIOCINAS EN QUESO

Durante los últimos años, el consumidor se ha vuelto más exigente en cuanto a calidad y expectativas de un producto saludable y fresco. Para satisfacer al consumidor es necesario investigar y encontrar opciones que permitan obtener alimentos que ofrezcan características interesantes renunciando al uso de algunos conservantes artificiales que puedan estar cada vez más rechazados y favoreciendo el uso de sustitutos que sean capaces de mantener el alimento en buenas condiciones y sean aptos para el consumo.

 En ésto se basa el estudio realizado por los autores del artículo Bacteriocins produced by wild Lactococcus lactis strains isolated from traditional, starter-free cheeses made of raw milk, orientado a la identificación de bacterias productoras de bacteriocinas con el fin de inhibir una amplia gama de microrganismos, incluídos microorganismos patógenos, lo que ha abierto un nuevo campo de investigación para tratar a pacientes con cepas resistentes a los antibióticos ya existentes, y algunos causantes del deterioro de los alimentos.

Para ello intentaron determinar qué cepas son productoras de bacteriocinas, bajo qué condiciones, y de qué bacteriocinas en concreto. Además de identificar los genes implicados en la formación de estos compuestos.

El procedimiento experimental seguido por los investigadores fue el que sigue:

1.                  Identificación y clasificación de aislamientos de Lactococcus Lactis:

Se aislaron 306 muestras de cinco distintos quesos tradicionales españoles (Casín, Cabrales, Genestoso, Peñamellera y Valle del Narcea). Mediante REP y RAPD se identificaron 60 cepas distintas, cada una de ellas con una huella dactilar característica. A partir de estas cepas se identificaron diferentes subespecies de L. lactis, lactis y cremoris mediante ARDRA.

2.                  Actividad antimicrobiana de cepas de L. lactis:

Tras haber identificado los tipos de microorganismos presentes en los aislamientos se procedió a identificar aquellas cepas que tuvieran actividad antimicrobiana poniéndolas en contacto con bacterias indicadoras primero se realizó un agar spot test para ver qué bacterias indicadoras eran inhibidas por qué cepas de los aislamientos obtenidos de los quesos.

Para asegurar que esta información obtenida fuese correcta se realiza un well-difussion assay mediante el cual se obtuvo que el número de cepas que daban un resultado positivo para la actividad antimicrobiana se redujo a 17 cepas.

3.                  Identificación de los genes que codifican bacteriocinas por PCR:

Para poder determinar en qué cepas estaban los genes productores de bacteriocinas, y cuales eran producidas por cada cepa, se diseñaron cebadores complementarios a los genes que codifican para nisina, lacticinas y lactococcinas, y mediante PCR se amplificaron las secuencias del genoma de cada cepa que complementaba con dichos cebadores. Posteriormente se sometieron a electroforesis para determinar, según el tamaño de cada banda, qué bacteriocina codificaba cada cepa.

4.                  Producción de bacteriocina en medio industrial y en laboratorio:

Más tarde se pasó a cuantificar la actividad inhibitoria de la nisina, comparando la de la obtenida en el laboratorio, con la comercial y también en distintos medios.

Además del descubrimiento de bacterias nuevas, también es importante para identificar cepas productoras de cantidades mas altas de antimicrobianos (particularmente los de amplio espectro) para su aplicación comercial.

En conclusión, en este experimento se descubrieron 17 productores de bacteriocinas de las 60 cepas estudiadas, 11 de los cuales producen nisina, 5 lactococcina 972 y 1 lactococcina G.

Referencia bibliográfica:

Bacteriocins produced by wild Lactococcus lactis strains isolated from traditional, starter-free cheeses made of raw milk 
International Journal of Food Microbiology

• Ángel Alegría, 
• Susana Delgado, 
• Clara Roces, 
• Belén López, 
• Baltasar Mayo

Realizado por:

Jose Miguel Crespo; Julieta G. Hamzé; Álvaro Herrero; Lara Romo

Producción de Biofuel

CONVERSIÓN DE PROTEINAS EN BIOFUEL POR INGENIERÍA DE FLUJO DE NITRÓGENO.

      Actualmente, la obtención de biofuel (alcoholes) se realiza a partir de carbohidratos y lípidos provenientes de diversos vegetales y conlleva la producción de proteínas como producto de desecho. Este producto secundario suele venderse a la industria ganadera como piensos. No obstante, esta industria no está preparada para amortiguar tan ingente cantidad de piensos. Además, esta acumulación de nitrógeno en forma de aminoácidos, que se agrava con la expansión de la esta industria, puede desequilibrar el ciclo de nitrógeno. Por tanto, se hace necesaria la búsqueda de un tratamiento para estos residuos proteicos.

La solución que nos plantean los autores del artículo Conversion of protein into biofuels by engineering nitrogen flux  es el tratamiento de estos residuos proteicos, para darles uso como materia prima en la producción de biofuel. Además, se obtendrían productos químicos de interés, como fármacos, plásticos… etc., utilizados en industria. Se presenta, por tanto, una alternativa versátil al petróleo, del que se derivan usualmente estos compuestos, además de extraer de él combustible.

Sin embargo, esta solución no es viable a día de hoy debido al alto coste que supone la desaminación de los aminoácidos (componentes de las proteínas), es decir, la eliminación de su grupo amino (ver imagen).

Estos investigadores, coordinados por James C Liao, han desarrollado un método mediante ingeniería metabólica que optimiza este proceso de desaminación. Es decir, han modificado el metabolismo de ciertos organismos para llevar a cabo el proceso de manera más eficiente.

Dada la dificultad de convertir los aminoácidos en biofueles de manera directa, debido al alto coste energético de esta reacción, se hace necesario realizar un paso intermedio: convertir los aminoácidos en cetoácidos, de los que sí podremos obtener alcoholes.

Pero, a pesar de esta desviación de la ruta normal, estas reacciones siguen siendo energéticamente desfavorables, por lo que se hace necesaria una fuerza que impulse todo este metabolismo. Para ello se usarán aminoácidos de nuevo que, en lugar de ser convertidos en cetoácidos,  serán desaminados a tricarboxilatos, desde los que se pueden obtener piruvato y obtener así el suplemento energético necesario.

Además, se bloqueará la recaptación de amoniaco inherente a la bacteria, de manera éste sólo saldría de la célula, con lo que las reacciones de desaminación se verían favorecidas por el desplazamiento del equilibrio hacia la aparición de amoniaco libre y con él, cetoácidos (Principio de Le Châtelier).

El procedimiento experimental seguido por los investigadores fue el que sigue:

Tomaron una estirpe inicial de Escherichia coli (JCL16), no productora de biofueles se llevaron a cabo una seria de métodos de modificación para obtener cepas de interés:

> Métodos para mutagenizar.

- Se mutagenizó al azar todo el genoma con N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).

- Recombinación homóloga con el fago P1 (mutagénesis dirigida).

> Métodos para seleccionar.

- Se utilizó un medio selectivo, en el que la única fuente de carbono eran proteínas, de manera que sólo crecerán en él cepas que sean capaces de servirse de proteínas como fuente de energía y carbono.

- Se añade norvalina, que  es un compuesto muy similar a la valina, y que  si se incorpora en una cadena polipeptídica resulta tóxica. Esta toxicidad sólo podría ser superada con una mutación de superproducción de la forma ceto de la valina, de modo que la bacteria sea capaz de sintetizar su propia valina a partir de la forma ceto y no requiera la captación de valina del medio. Si buscase valina exógena, también encontraría norvalina y, al incorporarla a sus cadenas moriría.

Secuencialmente, los pasos seguidos fueron los siguientes:

1. Modificar ruta de ceto-ácidos para dar carburantes. Se transforman las rutas de los ceto-ácidos para dar biofueles (alcoholes) y se prueba la producción de isobutanol.

2. Hacer estirpe menos sensible al etanol. Se muta un autoinductor (quorum-sensing) que se encarga de sensibilizar a la célula, de forma que detiene su crecimiento al alcanzarse en el medio ciertas concentraciones de alcohol, que no deja de ser para la célula un producto de desecho. En situaciones normales, se inhibe con la glucosa, pero al no haber más que proteínas como fuente de carbono, se hace necesaria una inhibición “forzada”. Se elegirán aquellos con menor sensibilidad a la presencia de alcoholes.

3. Eliminar la recaptación de NH₃.  Como ya hemos comentado anteriormente, mediante recombinación homóloga. Se eliminaron las proteínas encargadas de la captación de amoníaco (NH₃) de la bacteria.

4. Liberar los esqueletos peptídicos (modificar rutas de transaminación). Evitar que el grupo amino arrancado a un aminoácido se incorpore a otro cetoácido, lo cual es el mecanismo habitual en la célula, ya que esta tiende a no malgastar el nitrógeno, que suele ser un factor limitante.

Finalmente, se obtuvieron estirpes con una producción de alcoholes que ronda los 4000 mg de alcohol por litro de cultivo, lo cual demuestra que es posible usar las proteínas como materia prima para la producción de biofuel, con un rendimiento nada desdeñable (entorno al 56%). 

Es reseñable el aumento en la producción y el rendimiento que trae consigo la mutación de las rutas de transaminación (transamination cycles, en la figura adyacente). Además, considerando que este experimento se realizó a una escala relativamente pequeña, y que muchos de los procesos son aún susceptibles a mejorar, con lo que los horizontes de esta técnica parecen estar aún lejanos.

La investigación, hoy en día, de producción de biofueles de segunda generación se centra en el uso de algas, que requieren fotobiorreactores muy caros y cuenta con el problema adicional de la aparición de un compuesto recalcitrante, la lignocelulosa, que es un componente de la pared celular de las algas.

Con esta alternativa propuesta por los autores, se podrían evitar esos inconvenientes y además, no se desequilibraría el ciclo del nitrógeno (cerrándolo de manera sostenible) y teniendo posibles usos futuros como nitrógeno reciclado (refiriéndonos ahora al excedente de amonio que es expulsado por las estirpes). Por otro lado, se le daría a las proteínas mucha más utilidad de la que tienen actualmente. Al fin y al cabo, es un proceso a priori menos contaminante, más energético y más económico.

Es muy probable que las grandes ventajas que presentan la utilización de proteínas para la obtención de biofuel hagan que se empiece a desarrollar potencialmente esta alternativa y que se utilice a gran escala en los próximos años.

Referencia bibliográfica: 

Yi-Xin Huo, et al., 

Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.

Realizado por: Carlos Tarancón Pascual, Cristina Palacios Rodríguez, Daniel Blasco Espada, Eva Rodríguez Alcocer y Vicente Candela Noguera.

PACE (evolución continua y dirigida de biomoléculas)

Uno de los principales problemas a la hora de evolucionar biomoléculas en el laboratorio con el  fin de que adquieran propiedades nuevas son las numerosas rondas de mutaciones que se requieren para ello, lo cual conlleva mucho tiempo y trabajo por parte del experimentador. Un método para disminuir tanto el tiempo  requerido como la intervención humana es la PACE.

En la PACE (Phage Assisted Continuous Evolution; evolución continua asistida por fagos)  se utiliza un quimiostato (laguna) en el que previamente hay bacteriófagos modificados para que sean menos infectivos; así mismo en el quimiostato hay un flujo continuo de entrada y salida de bacterias. El bacteriófago contiene el gen que codifica la proteína de interés a evolucionar. El virus infecta a la bacteria y esta expresa el gen del virus, que codifica la proteína de interés; dicha proteína induce la expresión de un gen contenido en la bacteria necesario para la infectividad del virus.

En este método se utilizan tres plásmidos:

-El plásmido del virus (SP), que contiene el gen de la proteína a evolucionar, el gen de la polimerasa T7 y al que se ha eliminado el gen III, que codifica la proteína III (pIII) necesaria para la infectividad del virus.

-El plásmido accesorio (AP)  que contiene el gen III  y el promotor  de T7. Para la expresión de la proteína III se necesita la unión de la polimerasa de T7 a su promotor.

-El plásmido mutagénico  (MP) que aumenta la tasa de mutación inhibiendo los sistemas de corrección de errores en la replicación del material genético.

La bacteria inicialmente contiene el plásmido mutagénico y el plásmido accesorio; cuando el virus infecta a la bacteria le introduce el plásmido (SP) que contiene el gen de la polimerasa T7 (gen que codifica la proteína de interés). La bacteria expresa la polimerasa de T7 que se une al promotor de T7 permitiendo la expresión de la proteína III consiguiéndose  de esta forma que el virus pueda infectar a nuevas bacterias. Por tanto para la expresión del gen III se necesita que la polimerasa de T7 se una a su promotor específico (promotor de T7).

Se fuerza a evolucionar a la polimerasa de T7 a base de modificar progresivamente el promotor contenido en el plásmido accesorio de la bacteria: en un principio el plásmido accesorio contiene el promotor de T7, seguidamente se introducen en la laguna bacterias que contienen el plásmido accesorio con un promotor híbrido T7/T3 y finalmente bacterias cuyo plásmido accesorio contiene el promotor de T3. Así, de esta forma los virus que hayan sufrido una  mutación en el gen que codifica para la polimerasa de T7 podrán unirse a un promotor que no es específicamente el promotor T7, es decir, podrán unirse al promotor de T3 y expresar la pIII, por tanto, serán más infectivos y permanecerán en la laguna, mientras que los virus cuyo gen que codifica a la polimerasa de T7 no haya sufrido mutación no podrán unirse al promotor de T3, por tanto no podrán expresar la pIII, no podrán infectar a nuevas bacterias y serán lavados de la laguna.

La “evolución” de la polimerasa se basa por tanto en las mutaciones causadas indirectamente por el plásmido mutagénico, las cuales permitirán a la polimerasa T7 la unión a un promotor que no sea el de la polimerasa T7.

En conclusión, con este sistema se consigue la evolución de la polimerasa de manera rápida, sencilla, eficaz y con la mínima intervención del investigador, cosa que se puede ver con los resultados del experimento:

De la misma forma este proceso podemos aplicarlo a la evolución de otras biomoléculas siempre que podamos asociar la expresión de las mismas al gen III.

Diversidad y evolución de las poblaciones microbianas durante la fabricación y la maduración del queso Casín

Trabajo realizado por: Sarai Martínez Pacheco, Ana Peral Clement, Manuela Boluda Mora,

Begoña Arechavala Arbolí,  Mª Ángeles Martínez Gilabert

Casin es un queso tradicional español con Denominación de Origen Protegida (ODP).

Su forma de fabricarlo difiere de los métodos normalmente utilizados. Se elabora sin un cultivo iniciador, a partir de leche de vaca recién ordeñada de la raza Casina. Además, no se han realizado estudios microbianos en él por lo que su tipificación microbiana puede servir tanto para la evolución de sus condiciones higiénicas como para el diseño de cultivos iniciadores específicos y/o cultivos adjuntos.

El objetivo del presente estudio es analizar la diversidad microbiana de las poblaciones más importantes, hallar cultivos iniciadores de queso Casin tradicional y analizar su evolución a lo largo de su elaboración  mediante cultvio y DGGE. 

Para llevar a cabo este estudio se hicieron dos lotes de queso Casín en 2 lugares separados geográficamente y se cogieron muestras de la leche, la cuajada y el queso a los 3, 7, 15 y 30 días de maduración. Se llevaron a ensayo en tres medios de cultivo diferentes (PCMA, BA y BLA) y tres condiciones de cultivo diferentes (aerobios, microaerofilia y anaerobiosis). Se inocularon muestras de queso de 3 y de 30 días de uno de los productores en estos tres medios y se incubaron anaeróbicamente a 30ºC durante 72h.

Además, se llevo a cabo un conteo microbiano (aerobios mesófilos, lactococcus, etc.), análisis químicos para establecer los parámetros básicos del queso (pH, concentración de sal y proteínas, etc), la identificación molecular de las bacterias del ácido láctico por secuenciación del ARNr 16S (para la diferenciación interespecífica), la tipificación de Lactococcus por RAPD-PCR (para la diferenciación intraespecífica) y un análisis DGGE.

Resultados

En el coteo microbiano se obtuvieron poblaciones microbianas  bastante similares entre ambos lotes. Las bacterias del ácido láctico constituyen la mayoría de las poblaciones microbianas aisladas.

En los análisis químicos se observaron tendencias normales durante la maduración para la mayoría de las variables.

En el DGGE  se encontraron 14 bandas diferentes, de los cuales 13 fueron identificados por comparación con cualquiera de las bandas de las cepas de control. La banda más prominente en todas las muestras fue la de L. lactis (La banda i). En las muestras de cuajada y queso de 3 días, una banda débil se observó en la parte superior del gel, que fue identificado como L. garvieae (banda A).

De manera similar, nueve bandas se observaron para el dominio variable de levadura D1 el ADNr 26S.

 

Por cultivo se obtuvieron mayor número de recuperación bajo condiciones anaerobias. En las muestras de queso a los 3 y 30 días se aislaron en total 180 colonias 86 días a partir de tres días y 94 de 30). Los resultados se resumen en la siguiente tabla:

Por último, solo se obtuvo un perfil RAPD  L. garvieae, indicando que el proceso de acidificación estaba dominado por una cepa. En contraste, ocho patrones RAPD distintos se encontraron entre los aislamientos de L. lactis  

Algunos perfiles RAPD del día 3 son diferentes a los de día 30, lo que sugiere un cierto grado de evolución de las cepas. Sin embargo, dos aislamientos del día 3 y de día 30 mostraron patrones idénticos, lo que indica que algunas cepas de L. lactis puede estar bien adaptada al proceso de elaboración del queso entero.

 

Conclusiones

Las pequeñas diferencias que se observaron entre los lotes en la mayoría de las variables medidas, pueden reflejar las variaciones en condiciones ambientales no controladas, así como las diferencias en la composición de la leche y la carga microbiana de los lotes.

La diversidad microbiana encontrada con las dos técnicas  (cultivo convencional y DGGE) en el queso Casín fue similar. Sin embargo, como se comparó reiteradamente con otros quesos, se observó  discrepancias en los microorganismos detectados. Estas diferencias pueden atribuirse a algunas de las limitaciones de estas dos técnicas (excesiva selectividad de algunos medios, la lisis diferencial de las poblaciones microbianas y la presencia de ADN amplificable de microorganismos muertos). A pesar de esto, la caracterización microbiana de queso Casín ha proporcionado muchas diferencias en la composición microbiana y la evolución en comparación con otros quesos tradicionales.

Por otro lado, fue sorprendente encontrar L. garvieae como la especie dominante durante la acidificación. Estas cepas de L. garvieae en lácteos presentan una serie de propiedades deseables y algunos autores proponen la utilización de cepas caracterizadas como parte de los cultivos siempre que exista ausencia de factores de virulencia y patogenicidad.

Se destaca además de los resultados, la presencia de una banda DGGE correspondiente a S. thermophilus. Esta especie nunca ha sido aislada en quesos tradicionales españoles.

La presencia de un alto número de coliformes, enterococos y organismos relacionados también es típica de los quesos elaborados con leche recién ordeñada. Las especies de estos tipos de microorganismos se han detectado tanto por el cultivo y DGGE en muchos otros quesos de elaboración similar. Estas poblaciones son consideradas como indicadores de contaminación fecal y por lo tanto también indican las malas prácticas de fabricación.  Esto refuerza la idea de necesidad de mejorar las condiciones de higiene en toda la fabricación Casín. 

Artículo original:  

“Diversity and evolution of the microbial populations during manufacture and ripening of Casín, a tradicional Spanish, starter free cheese made from cow’s milk”
International Journal of food Microbiology

Ángel Alegría, Pablo Álvarez-Martín, Noelia Sacristán, Elena Fernández, Susana Delgado, Baltasar Mayo