Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


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viernes, 29 de mayo de 2015

Mejora de la eficiencia de la producción de butanol por fermentación de lignocelulosa absorbida

El origen de la bioproducción de butanol está en la Primera Guerra Mundial, donde los ingleses andaban escasos de acetona para la fabricación de municiones. Problema al que dió solución un químico de origen ruso, Chain Weizmann. Este desarrolló la fermentación butanol-acetona utilizando a la bacteria anaerobia Clostridium acetobutylicum, ya que es la única capaz de fermentar xilosa, pero en mezclas con glucosa y xilosa primero consume la glucosa y la xilosa la deja para el final.
Actualmente hay dos formas de producir butanol, la primera y la más utilizada es la producción físico-química de derivados del petróleo; la segunda es mediante la bioproducción en las fermentaciones conocidas como ABE.

Se utiliza como sustrato para la fermentación los restos no utilizados del maíz. Estos rastrojos se secan y se machacan obteniendo fragmentos que se mojan con agua destilada. El pretratamiento realizado es el siguiente:

          Rastrojo + explosión de vapor
       SECS(steam-exploded corn stover)
                 

                     SECS + NaOH
 
         SECSAT (SECS Alkali-Treated)

Dicho pretratamiento es importante para obtener el mejor sustrato posible para la fermentación; después de esto, el SECSAT se seca y se almacena.
La fermentación para producir biobutanol se puede llevar a cabo de tres formas:
  1. Fermentación sumergida (SMF), la más utilizada actualmente.
  2. Fermentación en sistema sólido, que presenta algunas ventajas, como la mejora del rendimiento y de las características del producto, pero otros problemas como crecimiento limitado por el bajo contenido de agua.
  3. Fermentación en lignocelulosa absorbente (ALF), que debido a su alta porosidad tiene una mayor capacidad de retención de agua.

Antes de hablar sobre la aplicabilidad, hay que mencionar las diferentes fuentes de carbono.
Según los resultados obtenidos en un primer experimento en el que se analizaron la glucosa y la xilosa, se concluyó que la glucosa es el sustrato preferente, puesto que da un mayor rendimiento y su productividad es mayor. Este experimento se llevó a cabo sin eliminar la lignina.
Tras eliminar la lignina, los cambios observables, son:

  • El contenido en etanol disminuyó significativamente, sobre todo en la fermentación de la xilosa.
  • El contenido relativo de acetona en el disolvente aumentó en la glucosa, así como en la xilosa.
  • En lo que respecta al butanol apenas hubo grandes cambios en su concentración.
Estos cambios provocan problemas económicos en la fermentación de ABE. Por tanto, se buscaron otras alternativas como son la producción ABE por cofermentación de glucosa y xilosa. Este proceso es muy importante para abaratar el coste de la fermentación.
Se estudia posteriormente el rendimiento de este microorganismo en ALF y se obtienen los siguientes resultados:
En la tabla 2 se muestra la eficacia de la fermentación de tres mezclas de azúcar con diferentes proporciones de cada componente.

Se puede observar que el aumento de la proporción de xilosa causa un efecto negativo.  Se demostró que la glucosa inhibe parcialmente la utilización de xilosa en las mezclas.

En la tabla 3 se muestra el contenido de lignina en SECS y en SECSAT.

Los resultados obtenidos muestran como el contenido de lignina disminuye en SECSAT. También se muestra que la lignina ha conseguido aumentar la porosidad y también la superficie específica del transportador. Por todo ello podemos afirmar que el SECSAT es el más apto para ser utilizado como un transportador absorbido por los microorganismos.
La tabla 1 recoge los datos comparativos de la fermentación entre SECS y SECSAT.
Se demuestra el efecto de mejoría en la extracción de lignina en ALF. Fila 3, mayor rendimiento. Por lo tanto, el SECSAT es usado como un apoyo, no como una fuente de nutrientes.

Mediante la sacarificación y fermentación parcial (PSSF) del SECSAT, se obtienen más azúcares libres y de esta manera, se reduce el coste de las fermentaciones. Para conseguir la sacarificación y fermentación parcial durante el proceso de fermentación se añade celulasa. Los resultados que se obtuvieron mediante dicho proceso fueron los siguientes: 
Los resultados obtenidos muestran un rendimiento mayor de ALF en presencia de la enzima.
















En este diagrama se resume el proceso de producción de butanol y la obtención de otros productos secundarios.


¿Cuáles son los intereses de todo este proceso de producción de butanol?
La producción de butanol tiene dos principales intereses, uno como producto químico para la fabricación de pinturas, detergentes, explosivos, entre otros, la otra como combustible líquido alternativo a los combustibles fósiles. Sin embargo, la producción de biobutanol todavía no es económicamente competitiva, debido principalmente a la baja concentración de butanol en caldo de fermentación. Por eso se busca el desarrollo de una nueva tecnología que abarate los costes y aumente el rendimiento.
Una de las alternativas estudiadas es la producción de butanol por ALF, ya que no solo aumenta el rendimiento del ABE, sino también se produce un cambio en la relación del disolvente.
Como conclusiones de dicho estudio se obtuvo que la fermentación mixta de pentosas y glucosas muestra una fermentabilidad mayor, aunque menor que el nivel medio de la fermentación de azúcares separados. Además, PSSF de SECSAT para la producción de butanol podría aumentar el poder de fermentación y preparar un excelente material de fabricación de papel. También, la lignina que ha quedado en disolución en la solución alcalina del SECSAT se podría separar para producir productos derivados de lignina, y el NaOH en disolución podría ser recuperado y reutilizado. Todos estos resultados pueden economizar la producción industrial de la ABE.

BIOBLIOGRAFÍA
Qin He and Hongzhang Chen, (2012). Improved efficiency of butanol production by absorbed lignocellulose fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering, Volume 115, Issue 3, Pages 298-302.

ALFONSO AZORÍN GUAITA
FRANCISCO JOSÉ CANDELA MOLLÁ
JULIÁN JOSÉ DUQUE PEDRAZA
PEDRO GUZMÁN BLASCO
ALEJANDRO ELEAZAR PEÑIN FRANCH

Mejora de la producción de MEL por Pseudozyma hubeiensis SY62

Los biosurfactantes (surfactantes producidos por seres vivos) son compuestos que facilitan la mezcla de una sustancia acuosa con una sustancia aceitosa, y son de gran interés en diversas industrias (cosmética, minera, ambiental –en biorremediación-, farmacéutica –como transportadores de fármacos-, etc.). Uno de los biosurfactantes más apreciados son los lípidos de manosileritritol (MEL), que son un tipo de glucolípidos producidos por hongos y bacterias. Se clasifican según su estructura química en MEL-A, MEL-B, MEL-C y MEL-D.

Los MEL son de interés no solo por ser buenos biosurfactantes y tener unas condiciones de producción suaves, sino además por tener otras propiedades que se han demostrado en ciertos estudios (actividad antimicrobiana, unión a la inmunoglobulina G humana, posible terapia contra la leucemia, aumentan la eficacia de ciertas terapias génicas en mamíferos, etc).

Debido a su gran interés como biosurfactante, el investigador japonés Masaaki Konishi y su equipo se propusieron hallar las condiciones óptimas para la producción de MEL mediante cultivo de lote alimentado o fed-batch (que consiste en crecer microorganismos aportándoles los nutrientes que necesitan de forma continua o secuencial). El objetivo es recortar los costes de producción de MEL y obtener la máxima productividad posible. Para ello han empleado como microorganismo productor Pseudozyma hubeiensis SY62, una cepa de levadura aislada del fondo del mar Sagami. Esta levadura produce principalmente MEL-C, aunque también MEL-A y MEL-B.

En primer lugar, se determinó la producción de MEL en condiciones preliminares. Éstas fueron: 200 rpm de velocidad de agitación, 25ºC de temperatura, 50 g/L de aceite de oliva, 50 g/L de glucosa y 2 g/L de extracto de levadura. El resultado fue 7,5 g MEL/L al día, siendo, el objetivo del presente estudio, superar dicho valor de producción.

Así, se realizaron diversos experimentos, en los que se modificaron los siguientes parámetros: velocidad de agitación, temperatura, concentración de extracto de levadura y concentración de las fuentes de carbono (aceite de oliva y glucosa).


Para comprobar que la velocidad de agitación empleada en el experimento inicial era la óptima, estudiaron su efecto en el crecimiento celular y en la producción de MEL. Los resultados mostraron que la velocidad de agitación afecta de forma insignificante al crecimiento celular. Sin embargo, velocidades de agitación menores de 150 rpm o mayores de 200 rpm tienen como resultado una menor producción de MEL. Por tanto, la velocidad de agitación óptima está entre 150 y 250 rpm, lo que confirma que la velocidad de agitación elegida inicialmente, 200 rpm, era correcta. Por eso, para el resto de los experimentos, se siguió utilizando esa velocidad.


También se estudió si la velocidad de agitación afectaba a los distintos tipos de MEL producidos, llegando a la conclusión de que no afectaba. La fracción de MEL-C fue de aproximadamente 70% a todas las velocidades de agitación, la de MEL-A fue del 30% y la de MEL-B fue insignificante.




A continuación, comprobaron si la temperatura empleada inicialmente era la óptima. Para ello, estudiaron el efecto de la temperatura en la producción de MEL y en el crecimiento celular. Así realizaron varios cultivos a diferentes temperaturas, y se vio que el crecimiento celular se estimulaba al ir aumentando la temperatura hasta aproximadamente 34ºC, a partir de la cual caía drásticamente. En cuanto a la producción de MEL, mostraba un máximo a los 25ºC y se inhibía por encima de los 28ºC. Concluyeron por tanto que la temperatura elegida inicialmente, 25ºC, era la óptima. Dicha temperatura es menor que las de otras levaduras productoras de MEL del mismo género, cuyos valores van desde 28ºC a 32ºC.

También se estudió el efecto de la temperatura en los diferentes tipos de MEL producidos. Los resultados de los experimentos muestran que la producción de MEL-B es despreciable y no varía con la temperatura, mientras que el ratio de MEL-C va aumentando desde los 15ºC hasta los 35ºC, y el ratio de MEL-A va disminuyendo en la misma medida. Sabiendo esto, se podrá adecuar la temperatura en los procesos de producción de MEL dependiendo de cuál sea el tipo de MEL que se desea obtener.


Tabla: Producción de MEL a diferentes concentraciones de las fuentes de carbono
y del extracto de levadura.

Seguidamente, se estudió el efecto de la concentración de extracto de levadura (tabla 1). Manteniendo constante la concentración de las fuentes de carbono (aceite de oliva y glucosa), se aprecia que al aumentar el extracto de levadura aumenta la producción de MEL y el crecimiento celular (tabla 1, intentos 1-4, 5-6, 7-8, 9-10). En los intentos del 1 al 4, se observa que al aumentar el extracto de levadura, la producción de MEL aumenta pero no tanto como en el resto de experimentos realizados a concentraciones de fuentes de carbono superiores. Esto se debe a que en los intentos 1-4 la concentración de fuentes de carbono es insuficiente (50 g/L). Por otro lado, en los intentos 7-8 y 9-10, las fuentes de carbono están en exceso, y vemos que, al aumentar el extracto de levadura, la producción de MEL aumenta bastante, pero todos los valores de producción de MEL ya son menores que el máximo obtenido en el intento 6 (49,2 g MEL/L). Por tanto, se puede afirmar que existe una inhibición en la producción de MEL y en el crecimiento celular cuando las fuentes de carbono están en exceso (a partir de 150 g/L), así pues, por más fuentes de carbono que se añadan, no se va a obtener una mayor producción de MEL, sino que ésta incluso disminuirá (tabla 1, 7-10).

También se estudió en estos cultivos el efecto del pH. Los pH finales variaron entre 4’9 y 6’4 (tabla 1, última columna), pero sin seguir un patrón fijo. Por tanto, se dedujo que no había una correlación significante entre el pH final y la producción de MEL y el crecimiento celular. 

Así, de todos estos experimentos, se concluye que las condiciones óptimas de cultivo son: 200 rpm de velocidad de agitación; 25ºC de temperatura; 10 g/L de extracto de levadura; 100 g/L de glucosa y 100 g/L de aceite de oliva (que es lo había en el intento 6 de la tabla 1). 

Finalmente, siguiendo estas condiciones se preparó un cultivo fed-batch de Pseudozyma hubeiensis SY62. Así, se observa que la concentración de MEL. Tres días después de la inoculación de SY62, se comprobó que las fuentes de carbono adicionadas se habían agotado, por lo que se volvió a añadir la misma concentración de glucosa y de aceite de oliva. La concentración de MEL alcanzó los 129 g/L el séptimo día. La productividad volumétrica calculada fue de 18,4 g/L al día (mientras que la del experimento inicial era de 7,5 g MEL/L al día).

                                       

En cuanto al peso seco de las células, en el tercer día alcanzó el valor de 40 g/L y permaneció constante desde entonces. En el séptimo día se comprobó que no había glucosa ni aceite de oliva en el medio, ya que se habían consumido por completo. El coeficiente de rendimiento fue de 0,33 g MEL/g fuentes de carbono. Además, se observó que la proporción de los distintos tipos de MEL se había mantenido constante durante todo el cultivo, siendo la proporción de MEL-C un 62,1%, la de MEL-A un 30,8% y la de MEL-B un 7,1%.                         

La productividad volumétrica de MEL resultante de la cepa SY62 en las condiciones óptimas descritas ha sido la más alta registrada hasta el momento, lo que tendrá un gran impacto, ya que permitirá recortar los gastos de producción de MEL.


Resumen realizado por:
Khouloud Tassnim Abidi, Daniel Cazorla Barrero, Helena Codina Márquez y Sara Fontcuberta Cervera.
Basado en el artículo:
Masaaki Konishi, Takahiko Nagahama, Tokuma Fukuoka, Tomotake Morita, Tomohiro Imura, Dai Kitamoto and Yuji Hatada.
Yeast extract stimulates production of glycolipid biosurfactants mannosylerythritol lipids, by Pseudozyma hubeiensis SY62.
Journal of Bioscience and Bioengineering. Volume 111, Issue 6, June 2011, Pages 702–705 doi:10.1016/j.jbiosc.2011.02.004

Sobreexpresión de la cefalosporina C acilasa contiene mutaciones en el túnel de transporte de sustrato.





La búsqueda de productos que aumenten la calidad de vida de la población está a la orden del día. La biotecnología es un claro ejemplo de ello y cada vez se hace mayor hincapié en la búsqueda de nuevos fármacos y mejora de éstos. Un ejemplo de esto son los antibióticos, que como se muestra en el estudio realizado se está intentando mejorar la eficiencia de estos compuestos mediante la compresión del mecanismo de acción de los mismos.




En el estudio que se ha realizado, basado en el artículo "Overexpression of synthesized cephalosporin C acylase containing mutations in the substrate transport túnel", lo que se pretende es mejorar la eficiencia de un antibiótico, en este caso la cefalosporina C.

La cefalosporina C pertenece a una clase de antibióticos beta-lactámicos que recibe el nombre de cefalosporinas. Uno de los intermediarios más importantes para dicho antibiótico es 7-ACA. Las reacciones necesarias para la producción de este intermediario conlleva condiciones rigurosas y residuos tóxicos. Por ello se buscan rutas alternativas que mejoren esta conversión.
Para la obtención de los resultados esperados, con el uso de bacterias, enzimas y productos químicos adecuados, se diseño una PCR  de SCPCAcy. Se construyo un plásmido y se muto la enzima sCPCAcy, y se hizo un cultivo de células, sobreexpresandose y se probó su actividad. Gracias a esto, pudo obtenerse el modelo de estructura tridimensional de la enzima. Por último, se obtuvo la enzima purificada.
Mediante la obtención de 12 mutantes se llegó a la conclusión de que mutando determinados residuos de aminoácidos localizados en el túnel de transporte de sustrato se obtendría una mayor actividad para la producción de 7-ACA. Además se obtuvo un nuevo diseño de CPC acilasa (enzima que cataliza la reacción), que fue sintetizada y sobreexpresada en un recombinante de E.coli.
Se realizó un estudio a fondo sobre la estructura de esta enzima; conociéndose su estructura tridimensional, así como los aminoácidos que gozaban de mayor importancia en la actividad enzimática. Así, se estudiaron los aminoácidos que formaban parte de su centro activo, aquellos que estaban presentes en el túnel de transporte de sustrato (desvelándonos la importancia que este tenía en su actividad), etc.
Con ello se pudo conseguir el objetivo indicado anteriormente, ya que se redujo el tiempo de reacción y la descomposición de CPC/7-ACA. El principal responsable de esto fue uno de los mutantes, el sCPCAcyA67G,que consiguió aumentar la productividad considerablemente, en comparación con la enzima silvestre, en un 35%.

Referencia bibliográfica y autores:
“Overexpression of synthesized cephalosporin C acylase containing mutations in the substrate transport tunel”
Ying Wang, Huimin Yu, Wensi Song, Mung An, Jing Zhang, Hui Luo y Zhongyao Shen.
Tsinghua University and University of Science and Technology, Beijing

Grupo de trabajo:  
Irene Delgado Alonso, Ainhoa González Piñeiro, María Martínez Cabanes y Claudia Victoria  Pérez Almería.