Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


También podrás encontrar diversas páginas y blogs relacionados con el mundo de la Microbiología. El material que se presenta en ellos puede ser utilizado en clase.


sábado, 2 de junio de 2012

Producción de Biofuel

CONVERSIÓN DE PROTEINAS EN BIOFUEL POR INGENIERÍA DE FLUJO DE NITRÓGENO.

      Actualmente, la obtención de biofuel (alcoholes) se realiza a partir de carbohidratos y lípidos provenientes de diversos vegetales y conlleva la producción de proteínas como producto de desecho. Este producto secundario suele venderse a la industria ganadera como piensos. No obstante, esta industria no está preparada para amortiguar tan ingente cantidad de piensos. Además, esta acumulación de nitrógeno en forma de aminoácidos, que se agrava con la expansión de la esta industria, puede desequilibrar el ciclo de nitrógeno. Por tanto, se hace necesaria la búsqueda de un tratamiento para estos residuos proteicos.

La solución que nos plantean los autores del artículo Conversion of protein into biofuels by engineering nitrogen flux  es el tratamiento de estos residuos proteicos, para darles uso como materia prima en la producción de biofuel. Además, se obtendrían productos químicos de interés, como fármacos, plásticos… etc., utilizados en industria. Se presenta, por tanto, una alternativa versátil al petróleo, del que se derivan usualmente estos compuestos, además de extraer de él combustible.

Sin embargo, esta solución no es viable a día de hoy debido al alto coste que supone la desaminación de los aminoácidos (componentes de las proteínas), es decir, la eliminación de su grupo amino (ver imagen).


Estos investigadores, coordinados por James C Liao, han desarrollado un método mediante ingeniería metabólica que optimiza este proceso de desaminación. Es decir, han modificado el metabolismo de ciertos organismos para llevar a cabo el proceso de manera más eficiente.
Dada la dificultad de convertir los aminoácidos en biofueles de manera directa, debido al alto coste energético de esta reacción, se hace necesario realizar un paso intermedio: convertir los aminoácidos en cetoácidos, de los que sí podremos obtener alcoholes.
Pero, a pesar de esta desviación de la ruta normal, estas reacciones siguen siendo energéticamente desfavorables, por lo que se hace necesaria una fuerza que impulse todo este metabolismo. Para ello se usarán aminoácidos de nuevo que, en lugar de ser convertidos en cetoácidos,  serán desaminados a tricarboxilatos, desde los que se pueden obtener piruvato y obtener así el suplemento energético necesario.

Además, se bloqueará la recaptación de amoniaco inherente a la bacteria, de manera éste sólo saldría de la célula, con lo que las reacciones de desaminación se verían favorecidas por el desplazamiento del equilibrio hacia la aparición de amoniaco libre y con él, cetoácidos (Principio de Le Châtelier).

El procedimiento experimental seguido por los investigadores fue el que sigue:
Tomaron una estirpe inicial de Escherichia coli (JCL16), no productora de biofueles se llevaron a cabo una seria de métodos de modificación para obtener cepas de interés:

> Métodos para mutagenizar.
- Se mutagenizó al azar todo el genoma con N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).
Recombinación homóloga con el fago P1 (mutagénesis dirigida).
> Métodos para seleccionar.
- Se utilizó un medio selectivo, en el que la única fuente de carbono eran proteínas, de manera que sólo crecerán en él cepas que sean capaces de servirse de proteínas como fuente de energía y carbono.
- Se añade norvalina, que  es un compuesto muy similar a la valina, y que  si se incorpora en una cadena polipeptídica resulta tóxica. Esta toxicidad sólo podría ser superada con una mutación de superproducción de la forma ceto de la valina, de modo que la bacteria sea capaz de sintetizar su propia valina a partir de la forma ceto y no requiera la captación de valina del medio. Si buscase valina exógena, también encontraría norvalina y, al incorporarla a sus cadenas moriría.

Secuencialmente, los pasos seguidos fueron los siguientes:

1. Modificar ruta de ceto-ácidos para dar carburantes. Se transforman las rutas de los ceto-ácidos para dar biofueles (alcoholes) y se prueba la producción de isobutanol.
2. Hacer estirpe menos sensible al etanol. Se muta un autoinductor (quorum-sensing) que se encarga de sensibilizar a la célula, de forma que detiene su crecimiento al alcanzarse en el medio ciertas concentraciones de alcohol, que no deja de ser para la célula un producto de desecho. En situaciones normales, se inhibe con la glucosa, pero al no haber más que proteínas como fuente de carbono, se hace necesaria una inhibición “forzada”. Se elegirán aquellos con menor sensibilidad a la presencia de alcoholes.
3. Eliminar la recaptación de NH3.  Como ya hemos comentado anteriormente, mediante recombinación homóloga. Se eliminaron las proteínas encargadas de la captación de amoníaco (NH3) de la bacteria.
4. Liberar los esqueletos peptídicos (modificar rutas de transaminación). Evitar que el grupo amino arrancado a un aminoácido se incorpore a otro cetoácido, lo cual es el mecanismo habitual en la célula, ya que esta tiende a no malgastar el nitrógeno, que suele ser un factor limitante.

Finalmente, se obtuvieron estirpes con una producción de alcoholes que ronda los 4000 mg de alcohol por litro de cultivo, lo cual demuestra que es posible usar las proteínas como materia prima para la producción de biofuel, con un rendimiento nada desdeñable (entorno al 56%). 

Es reseñable el aumento en la producción y el rendimiento que trae consigo la mutación de las rutas de transaminación (transamination cycles, en la figura adyacente). Además, considerando que este experimento se realizó a una escala relativamente pequeña, y que muchos de los procesos son aún susceptibles a mejorar, con lo que los horizontes de esta técnica parecen estar aún lejanos.

La investigación, hoy en día, de producción de biofueles de segunda generación se centra en el uso de algas, que requieren fotobiorreactores muy caros y cuenta con el problema adicional de la aparición de un compuesto recalcitrante, la lignocelulosa, que es un componente de la pared celular de las algas.

Con esta alternativa propuesta por los autores, se podrían evitar esos inconvenientes y además, no se desequilibraría el ciclo del nitrógeno (cerrándolo de manera sostenible) y teniendo posibles usos futuros como nitrógeno reciclado (refiriéndonos ahora al excedente de amonio que es expulsado por las estirpes). Por otro lado, se le daría a las proteínas mucha más utilidad de la que tienen actualmente. Al fin y al cabo, es un proceso a priori menos contaminante, más energético y más económico.

Es muy probable que las grandes ventajas que presentan la utilización de proteínas para la obtención de biofuel hagan que se empiece a desarrollar potencialmente esta alternativa y que se utilice a gran escala en los próximos años.



Referencia bibliográfica: 
  • Yi-Xin Huo, et al.
  • Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.


    Realizado por: Carlos Tarancón Pascual, Cristina Palacios Rodríguez, Daniel Blasco Espada, Eva Rodríguez Alcocer y Vicente Candela Noguera.


    viernes, 1 de junio de 2012

    PACE (evolución continua y dirigida de biomoléculas)




    Uno de los principales problemas a la hora de evolucionar biomoléculas en el laboratorio con el  fin de que adquieran propiedades nuevas son las numerosas rondas de mutaciones que se requieren para ello, lo cual conlleva mucho tiempo y trabajo por parte del experimentador. Un método para disminuir tanto el tiempo  requerido como la intervención humana es la PACE.

    En la PACE (Phage Assisted Continuous Evolution; evolución continua asistida por fagos)  se utiliza un quimiostato (laguna) en el que previamente hay bacteriófagos modificados para que sean menos infectivos; así mismo en el quimiostato hay un flujo continuo de entrada y salida de bacterias. El bacteriófago contiene el gen que codifica la proteína de interés a evolucionar. El virus infecta a la bacteria y esta expresa el gen del virus, que codifica la proteína de interés; dicha proteína induce la expresión de un gen contenido en la bacteria necesario para la infectividad del virus.

    En este método se utilizan tres plásmidos:

    -El plásmido del virus (SP), que contiene el gen de la proteína a evolucionar, el gen de la polimerasa T7 y al que se ha eliminado el gen III, que codifica la proteína III (pIII) necesaria para la infectividad del virus.
    -El plásmido accesorio (AP)  que contiene el gen III  y el promotor  de T7. Para la expresión de la proteína III se necesita la unión de la polimerasa de T7 a su promotor.
    -El plásmido mutagénico  (MP) que aumenta la tasa de mutación inhibiendo los sistemas de corrección de errores en la replicación del material genético.




    La bacteria inicialmente contiene el plásmido mutagénico y el plásmido accesorio; cuando el virus infecta a la bacteria le introduce el plásmido (SP) que contiene el gen de la polimerasa T7 (gen que codifica la proteína de interés). La bacteria expresa la polimerasa de T7 que se une al promotor de T7 permitiendo la expresión de la proteína III consiguiéndose  de esta forma que el virus pueda infectar a nuevas bacterias. Por tanto para la expresión del gen III se necesita que la polimerasa de T7 se una a su promotor específico (promotor de T7).

    Se fuerza a evolucionar a la polimerasa de T7 a base de modificar progresivamente el promotor contenido en el plásmido accesorio de la bacteria: en un principio el plásmido accesorio contiene el promotor de T7, seguidamente se introducen en la laguna bacterias que contienen el plásmido accesorio con un promotor híbrido T7/T3 y finalmente bacterias cuyo plásmido accesorio contiene el promotor de T3. Así, de esta forma los virus que hayan sufrido una  mutación en el gen que codifica para la polimerasa de T7 podrán unirse a un promotor que no es específicamente el promotor T7, es decir, podrán unirse al promotor de T3 y expresar la pIII, por tanto, serán más infectivos y permanecerán en la laguna, mientras que los virus cuyo gen que codifica a la polimerasa de T7 no haya sufrido mutación no podrán unirse al promotor de T3, por tanto no podrán expresar la pIII, no podrán infectar a nuevas bacterias y serán lavados de la laguna.

    La “evolución” de la polimerasa se basa por tanto en las mutaciones causadas indirectamente por el plásmido mutagénico, las cuales permitirán a la polimerasa T7 la unión a un promotor que no sea el de la polimerasa T7.

    En conclusión, con este sistema se consigue la evolución de la polimerasa de manera rápida, sencilla, eficaz y con la mínima intervención del investigador, cosa que se puede ver con los resultados del experimento:







    De la misma forma este proceso podemos aplicarlo a la evolución de otras biomoléculas siempre que podamos asociar la expresión de las mismas al gen III.

    Diversidad y evolución de las poblaciones microbianas durante la fabricación y la maduración del queso Casín




    Trabajo realizado por: Sarai Martínez Pacheco, Ana Peral Clement, Manuela Boluda Mora,

    Begoña Arechavala Arbolí,  Mª Ángeles Martínez Gilabert



    Casin es un queso tradicional español con Denominación de Origen Protegida (ODP).
    Su forma de fabricarlo difiere de los métodos normalmente utilizados. Se elabora sin un cultivo iniciador, a partir de leche de vaca recién ordeñada de la raza Casina. Además, no se han realizado estudios microbianos en él por lo que su tipificación microbiana puede servir tanto para la evolución de sus condiciones higiénicas como para el diseño de cultivos iniciadores específicos y/o cultivos adjuntos.

    El objetivo del presente estudio es analizar la diversidad microbiana de las poblaciones más importantes, hallar cultivos iniciadores de queso Casin tradicional y analizar su evolución a lo largo de su elaboración  mediante cultvio y DGGE. 

    Para llevar a cabo este estudio se hicieron dos lotes de queso Casín en 2 lugares separados geográficamente y se cogieron muestras de la leche, la cuajada y el queso a los 3, 7, 15 y 30 días de maduración. Se llevaron a ensayo en tres medios de cultivo diferentes (PCMA, BA y BLA) y tres condiciones de cultivo diferentes (aerobios, microaerofilia y anaerobiosis). Se inocularon muestras de queso de 3 y de 30 días de uno de los productores en estos tres medios y se incubaron anaeróbicamente a 30ºC durante 72h.

    Además, se llevo a cabo un conteo microbiano (aerobios mesófilos, lactococcus, etc.), análisis químicos para establecer los parámetros básicos del queso (pH, concentración de sal y proteínas, etc), la identificación molecular de las bacterias del ácido láctico por secuenciación del ARNr 16S (para la diferenciación interespecífica), la tipificación de Lactococcus por RAPD-PCR (para la diferenciación intraespecífica) y un análisis DGGE.

    Resultados

    En el coteo microbiano se obtuvieron poblaciones microbianas  bastante similares entre ambos lotes. Las bacterias del ácido láctico constituyen la mayoría de las poblaciones microbianas aisladas.
    En los análisis químicos se observaron tendencias normales durante la maduración para la mayoría de las variables.

    En el DGGE  se encontraron 14 bandas diferentes, de los cuales 13 fueron identificados por comparación con cualquiera de las bandas de las cepas de control. La banda más prominente en todas las muestras fue la de L. lactis (La banda i). En las muestras de cuajada y queso de 3 días, una banda débil se observó en la parte superior del gel, que fue identificado como L. garvieae (banda A).
    De manera similar, nueve bandas se observaron para el dominio variable de levadura D1 el ADNr 26S.
     

    Por cultivo se obtuvieron mayor número de recuperación bajo condiciones anaerobias. En las muestras de queso a los 3 y 30 días se aislaron en total 180 colonias 86 días a partir de tres días y 94 de 30). Los resultados se resumen en la siguiente tabla:


    Por último, solo se obtuvo un perfil RAPD  L. garvieae, indicando que el proceso de acidificación estaba dominado por una cepa. En contraste, ocho patrones RAPD distintos se encontraron entre los aislamientos de L. lactis  
    Algunos perfiles RAPD del día 3 son diferentes a los de día 30, lo que sugiere un cierto grado de evolución de las cepas. Sin embargo, dos aislamientos del día 3 y de día 30 mostraron patrones idénticos, lo que indica que algunas cepas de L. lactis puede estar bien adaptada al proceso de elaboración del queso entero.

     


    Conclusiones

    Las pequeñas diferencias que se observaron entre los lotes en la mayoría de las variables medidas, pueden reflejar las variaciones en condiciones ambientales no controladas, así como las diferencias en la composición de la leche y la carga microbiana de los lotes.
    La diversidad microbiana encontrada con las dos técnicas  (cultivo convencional y DGGE) en el queso Casín fue similar. Sin embargo, como se comparó reiteradamente con otros quesos, se observó  discrepancias en los microorganismos detectados. Estas diferencias pueden atribuirse a algunas de las limitaciones de estas dos técnicas (excesiva selectividad de algunos medios, la lisis diferencial de las poblaciones microbianas y la presencia de ADN amplificable de microorganismos muertos). A pesar de esto, la caracterización microbiana de queso Casín ha proporcionado muchas diferencias en la composición microbiana y la evolución en comparación con otros quesos tradicionales.
    Por otro lado, fue sorprendente encontrar L. garvieae como la especie dominante durante la acidificación. Estas cepas de L. garvieae en lácteos presentan una serie de propiedades deseables y algunos autores proponen la utilización de cepas caracterizadas como parte de los cultivos siempre que exista ausencia de factores de virulencia y patogenicidad.
    Se destaca además de los resultados, la presencia de una banda DGGE correspondiente a S. thermophilus. Esta especie nunca ha sido aislada en quesos tradicionales españoles.
    La presencia de un alto número de coliformes, enterococos y organismos relacionados también es típica de los quesos elaborados con leche recién ordeñada. Las especies de estos tipos de microorganismos se han detectado tanto por el cultivo y DGGE en muchos otros quesos de elaboración similar. Estas poblaciones son consideradas como indicadores de contaminación fecal y por lo tanto también indican las malas prácticas de fabricación.  Esto refuerza la idea de necesidad de mejorar las condiciones de higiene en toda la fabricación Casín. 



    Artículo original:  

    Diversity and evolution of the microbial populations during manufacture and ripening of Casín, a tradicional Spanish, starter free cheese made from cow’s milk”
    International Journal of food Microbiology

    Ángel Alegría, Pablo Álvarez-Martín, Noelia Sacristán, Elena Fernández, Susana Delgado, Baltasar Mayo