Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


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miércoles, 29 de mayo de 2013

Los mutantes deficiente-respiratorios de Zymomonas mobilis muestran un mayor crecimiento y producción de etanol bajo condiciones aeróbicas y de alta temperatura

Zymomonas mobilis. Imagen insertada por el profesor. Fuente: EJBiotech


Autores
Takeshi Hayashi, Yoshifumi Furuta y Kensuke Furukawa
Introducción
Zymomonas mobilis es una bacteria Gram-negativa anaerobia facultativa que puede fermentar determinados azúcares a través de una ruta metabólica productora de bioetanol, en ocasiones, con mayor eficacia que las levaduras. Posee un ciclo de Krebs incompleto, carente de genes para 2 enzimas, pero posee unas características muy fuertes para realizar las vías de síntesis de pirúvico a partir de glucosa o gliceraldehído-3-fosfato. Este organismo también muestra una alta tasa de captación de azúcares, fermentando a etanol estos tipos específicos. Además, el rendimiento de síntesis de etanol como combustible es del 97%, muy superior al 90-93% de Saccharomyces cerevisiae.
Los genes de Z. mobilis implicados en su respiración aún son un misterio. Recientemente, se descubrió que el gen ndh (ZMO1113) es el único encargado en las rutas del NADH y NADPH. Su ruta metabólica es muy importante, ya que nos puede proporcionar claves para mejorar la producción de etanol.
Las cepas mutantes con deficiencias respiratorias, o RDM, son mucho más evidentes en las levaduras ya que poseen una mayor tasa de fermentación y un mayor rendimiento en la producción de etanol. Estas cepas mutantes aparecen de forma espontánea o mediante la exposición de agentes químicos como acriflavina. Sin embargo, en Z. mobilis aún no se ha descubierto la forma de inducir este tipo de mutación, aunque sí se han obtenido de forma artificial.
La fermentación a temperaturas altas reduce los costes de refrigeración y evita la contaminación por microorganismos mesófilos. Así, las cepas termo-tolerantes de Z. mobilis podrían ser beneficiosas para la fermentación de etanol a altas temperaturas. Una de tales cepas, TISTR 405, muestra una actividad de alto crecimiento y fermentación de etanol a 39 °C.
Materiales y métodos
Cepas y medios de cultivo
La especie Z. mobilis ZM6 (ATCC 29191) se utilizó al igual que la cepa silvestre y de ella se obtuvieron varias cepas RDM. El crecimiento celular y la producción de etanol se examinaron utilizando un medio que contiene 0,5% de extracto de levadura y 2% de glucosa; para medio sólido, 1,5% de agar. Antibióticos, tales como sulfato de estreptomicina (Sm), sulfato de gentamicina (Gm) y la rifampicina (RIF) y monosulfato de kanamicina (Km).
Aislamiento de cepas de RDM
Los mutantes resistentes a los antibióticos fueron aislados de la cepa de Z. mobilis silvestre ZM6. La cepa silvestre en fase estacionaria se inoculó en el medio líquido y 100 l se extendieron sobre los medios sólidos que contenian diversos antibióticos. Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de la cepa silvestre en medios líquidos y en medios sólidos fueron los siguientes: Rif, 10 mg / ml y 5 mg / ml; Sm, 300 mg / ml y 150 mg / ml; Gm, 15 g / ml y 10 mg / ml; Km, 30 mg / ml y 5 mg / ml, respectivamente. Las cepas resistentes aisladas fueron repetidamente y rutinariamente cultivadas en medios líquidos y sólidos con concentraciones aumentadas de los respectivos antibióticos para obtener mutantes con mayor resistencia. Además, dobles mutantes resistentes a los antibióticos tales como Sm / Km, Sm / Rif, Sm / Gm, Rif / Km, y Rif / Gm también fueron aislados en medios líquidos y sólidos. Las cepas mutantes se cultivaron durante toda una noche en el medio líquido sin antibióticos, y entonces 100 l de cada cultivo se extendió sobre tres tipos de medios sólidos que contienen etanol y glucosa [4% (v / v) ethanol/16% (w / v) glucosa, 5% / 16%, y% 5/14%, respectivamente]. Los medios sólidos se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente hasta que aparecieron las colonias.
Cultivo aeróbico y anaeróbica de cepas RDM
Se realizaron cultivos anaeróbicos (3 ml) sin agitación en tubos de ensayo a 30 ° C y 39 ° C (temperatura alta). Los cultivos aeróbicos se llevaron a cabo de la misma manera, pero estos se agitaron a 220 rpm. Los resultados obtenidos aquí se expresan como las medias de al menos tres experimentos. Se hicieron baños aeróbicos con los cultivos con un volumen de 2 litros trabajando en un fermentador de jarra de 5 litros con 300 rpm de agitación a 30 ° C, el oxígeno disuelto (DO) se controló continuamente. Cultivos de una noche se inocularon para su uso en todos los experimentos de crecimiento. El crecimiento celular se monitorizó mediante densidad óptica a 660 nm.
Los métodos de análisis
pO2 (saturación de oxígeno disuelto tanto por ciento) se midió mediante un electrodo de oxígeno de tipo galvánico. Se centrifugaron cultivos de una noche (100 ml) y se lavaron en tampón fosfato 10 mM (pH 6,9). A continuación, las células se resuspendieron en 1 L de la misma solución tampón y luego se transfirieron al fermentador de jarra de 5-L . El consumo de oxígeno de las células se midió utilizando un electrodo de oxígeno después de la adición de 2% de glucosa a 30 ° C. La concentración celular se determinó como DO 660, y la masa celular seca se calculó por referencia a una curva de calibración.
La concentración de etanol se determinó por cromatografía de gas. La columna era una columna en espiral (2 m por 3 mm de diámetro interno) rellena con un Q Porapak, y se utiliza a 155 °C. La concentración de etanol se calculó por referencia a una curva de calibración.
Preparación de ARN total
Los ARN totales para los experimentos de microarrays de ADN se extrajeron de los cultivos agitados de cepas silvestres y cepas RDM-4 cultivadas a 30 ° C, un cultivo anaeróbico de la cepa silvestre crecida a 30 ° C, y un cultivo anaeróbico de RDM-4 crecido a 38 ° C. Debido al bajo rendimiento de ARN total extraído a 39 ° C, la condición de alta temperatura se adoptó como 38 ° C. Las células se cultivaron hasta la fase logarítmica tardía y se trató inmediatamente con el reactivo de RNAprotect bacteriana para la estabilización de ARN. El ARN total se extrajo con un kit RNeasy Midi y se concentró con un RNeasy mini kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN extraído se cuantificó espectrofotométricamente.
Experimentos de microarrays de ADN
Los experimentos de expresión génica utilizando microarrays de ADN se realizaron por NimbleGen Systems, Inc.. En resumen, la matriz de todo el genoma de Z. mobilis se diseñó a partir de la fase de lectura abierta (ORF) de la cepa Z. mobilis ZM4. Los arrays se componen de sondas de oligonucleótidos 60-mer con dos repeticiones y 18 sondas únicas por gen (es decir, un total de 36 sondas por gen). El ARN extraído fue probado para la pureza y la integridad, y luego etiquetado con Cy3; la hibridación de microarrays, la adquisición de datos, y la normalización se llevó a cabo por NimbleGen.
Microarray datos de número de entrada
Los datos analizados de microarray en este estudio se han depositado en la Expresión Génica Omnibus (GEO)
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)
Los cebadores se diseñaron utilizando Primer-3 software. Las muestras de ARN almacenadas a -80°C (las mismas muestras utilizadas para los experimentos de microarrays de ADN) se utilizaron para la qPCR. La PCR transcriptasa inversa (RTPCR) se realizó usando el One-step qPCR kit, con la siguiente composición: el volumen de reacción total fue de 20 μl de los que 10 μl son de ARN-direct SYBR Green PCR Master Mix en tiempo real, 0,2 mM de cada cebador, 50 mM de Mn (OAc)2, y 20 pmol de ARN total como plantilla. La RT-PCR, incluyendo los pasos de la transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se llevó a cabo usando una ADN polimerasa. Las mezclas fueron primero desnaturalizadas a 95 ° C durante 30 s, y luego se llevó a cabo la RT a 61 ° C durante 20 min. El ciclo de PCR se realizó en 55 ciclos a 95 º C durante 5s, 55 º C durante 10 s, y 74 ° C durante 15 s. Las reacciones se realizaron en un instrumento Light-Cycler de PCR.
Ensayo de la concentración intracelular de peróxido de Hidrógeno
Las células cultivadas hasta la fase logarítmica tardía se recogieron y se lisaron por sonicación. El nivel de peróxido de hidrógeno intracelular se determinó mediante la oxidación de ión ferroso en la presencia de un indicador de ión férrico, naranja de xilenol. Cincuenta litros de extracto celular bruto se añadió a 950 litros de reactivo FOX [100 mM naranja de xilenol (Sigma), sulfato de amonio 250 mM ferroso, 100 mM de sorbitol y 25 mM de ácido sulfúrico]. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min y luego se centrifugó para eliminar cualquier material floculado antes de medir la OD560. La concentración de peróxido de hidrógeno se representa con nanomol por miligramo de proteína.
Resultados
Aislamiento de colonias mutantes con una alta capacidad de fermentación alcohólica bajo condiciones aeróbicas
Las colonias mutantes que poseían una alta capacidad fermentativa alcohólica fueron aisladas y diferenciadas mediante una técnica de cribado en mutantes altamente tolerantes a la glucosa y al alcohol y en varios mutantes resistentes a antibióticos. De estos, la colonia simple altamente resistente a antibióticos y la doble resistente a antibióticos, tendían a mostrar una alta capacidad de formación de colonias en el medio sólido con contenido en glucosa y etanol. Lo sorprendente, es que estas mismas colonias no presentan una tolerancia significante al etanol o la glucosa en comparación con el genotipo silvestre, sino que estos mutantes exhiben una mayor capacidad de producción de etanol bajo condiciones aeróbicas.
Crecimiento y producción de etanol de las colonias mutantes bajo condiciones aerobias y anaerobias
Las colonias más importantes fueron aisladas para mayor investigación, siendo sometidas a condiciones de aerobiosis y anaerobiosis para estudiar su producción de etanol.
Bajo condiciones anaerobias, las colonias mutantes presentaban una producción y un crecimiento similar a las colonias silvestres. Por lo que podemos concluir que no existe diferencia remarcable entre el crecimiento y la producción de etanol bajo condiciones de anaerobiosis entre colonias mutantes y silvestres.
En cambio, podemos observar que las colonias alcanzan un crecimiento máximo en condiciones aerobias. Concretamente, las colonias RDM-4 y RDM-8 mostraban el mayor crecimiento y productividad en medio aeróbico.
Consumo de oxígeno de las colonias mutantes
La evaluación de la respiración se llevó a cabo en un frasco fermentador ligado a un electrodo de Oxígeno disuelto. Todas las colonias mutantes estudiadas presentaron un consumo de oxígeno menor que las colonias silvestres, es decir, mostraron una diferencia respiratoria, por lo que son designadas como rdm. En concreto las RDM-4 y RDM-8 mostraron un consumo de oxígeno extremadamente bajo, de alrededor del 20-30% menos que las silvestres.
Crecimiento y producción de etanol de las colonias RDM bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas a alta temperatura
Bajo condiciones de estrés, se observó que las colonias RDM incrementaban su termotolerancia. Las colonias silvestres crecían a temperaturas de 39ºC, sinembargo, su productividad alcohólica decrecía a esa temperatura. Mientras tanto, todas las cepas RDM mostraron un crecimiento alto y alta producción de etanol, incluso a 39°C, bajo ambas condiciones: anaeróbicas y aeróbicas. Entre ellas, la cepa RDM-4 presentó el mayor índice de crecimiento y productividad.
Es conocido el efecto que tiene el acetaldehído en la inhibición del crecimiento y productividad en el crecimiento aeróbico de Z.mobilis. Sin embargo, este compuesto no fue detectado en ningún cultivo.
Análisis de microarrays ADN de capacidad de fermentación alta en condiciones aeróbicas y termotolerancia de RDM-4
Para investigar cómo las cepas RDM exhiben mayor fermentación de etanol bajo condiciones aeróbicas, se hizo el análisis de microarrays de ADN de la colonia RDM-4: este mutante mostró la mayor deficiencia respiratoria, aun así crece bien a 39 ° C y su producción de etanol es buena en cualquier condición.
La expresión de genes con ARN de las células cultivadas a 30 ° C bajo condiciones de crecimiento aeróbicas se comparó entre los de tipo silvestre y cepas RDM-4 cepas. De ello se concluyó que quince genes fueron transcritos de forma diferente. De ellos, tres estaban relacionados con la biosíntesis de cisteína (metE, cysK y cysD).
La especie Z. mobilis fermenta la glucosa a etanol a través de 3 vías diferentes en los que participan un total de 13 genes. La expresión de estos genes se comparó entre las colonias silvestres y las RDM-4 cultivadas a 30ºC, y la conclusión fue que los 13 genes examinados mostraron mayor expresión en RDM-4 que en la cepa silvestre.
Para confirmar la conclusión del análisis de microarrays se realizó una qPCR para los 13 genes. Los resultados confirmaron que la expresión de los 13 genes es mayor en RDM-4 que en la cepa de tipo silvestre bajo condiciones de crecimiento aeróbicas.
Para examinar el mecanismo de la termotolerancia de cepas RDM, se comparó la expresión de genes en anaerobiosis de la colonia RDM-4 cultivada a alta temperatura y la cepa de tipo silvestre cultivada a la temperatura óptima (30 ° C) bajo condiciones anaeróbicas: un total de 103 genes mostraron cambios significativos.
En el genoma de Z. mobilis ZM4, hay ocho proteínas de choque térmico (HSPs). Estos HSPs no fueron significativamente inducidos por estrés térmico, excepto en uno de ellos. Eso se debe a que los microorganismos poseen ciertos genes para protegerse contra el estrés oxidativo, que incluyen genes antioxidantes que codifican la superóxido dismutasa, la catalasa, la tiorredoxina, y la glutarredoxina.
Además, los genes de reparación del ADN también son inducidos por el estrés oxidativo. Sin embargo, nueve genes antioxidantes y 17 genes de reparación del ADN en Z. mobilis no mostraron alteraciones significativas en la respuesta al estrés por calor, a excepción de 2 genes de reparación.
Nivel de peróxido de hidrógeno intracelular de las cepas RDM bajo condiciones de alta temperatura
Los diversos estudios de S. cerevisiae sugirieron que el estrés por calor provoca estrés oxidativo, que es un factor de estrés importante bajo condiciones de alta temperatura.
Para estimar el mecanismo de termotolerancia de cepas RDM, se midieron los niveles intracelulares de peróxido de hidrógeno de cepas RDM bajo condiciones de alta temperatura. RDM-4 y RDM-8 mostraron niveles significativamente reducidos de peróxido de hidrógeno intracelular.
Estos resultados indican que las cepas RDM, en particular, RDM-4 y RDM-8 sufren estrés oxidativo mucho más bajo que la cepa de tipo silvestre bajo condiciones de alta temperatura.
Conclusiones
Por estos resultados, se ha considerado que la reducción de estrés oxidativo intracelular y la reducción de la acumulación de acetaldehído en las variedades de RMD, produce un aumento en el crecimiento y en la energía que fluye de glucosa a etanol bajo condiciones aeróbicas. El grado de deficiencia respiratoria refleja el crecimiento y fermentación alcohólica, particularmente a altas temperaturas. Adicionalmente, la termotolerancia en las variedades RMD es resultado del estrés oxidativo. Los esfuerzos del equipo científico se centran en la caracterización de los genes y proteínas responsable de la generación de las variedades RMD en Z.mobilis para su futura mejora.

Ethanol fermentation driven by elevated expression of the G1 cyclin gene CLN3 in sake yeast.






El sake es una bebida originaria de Japón que se produce por la fermentación de glucosa y sacarificación del almidón del arroz de forma simultánea.

Sacarificación: Conversión por hidratación de las sustancias sacarígenas en azúcar. Romper polisacáridos para conseguir glúcidos de menos tamaño, se hace con Aspergillus oryzae.

Fermentación: Por levadura perteneciente a la familia de levaduras de gemación de Saccharomyces cerevisiae.

Todas las cepas de sake examinadas aquí exhiben características morfológicas comunes que se observan en mutantes de whisky (whi) que muestran transiciones G1 / S aceleradas. La cepa del sake mostró una menor eficiencia en la detención G1/G0 una expresión elevada del gen G1 ciclina CLN3 durante todo el período de fermentación. Además, la supresión de CLN3 afectó notablemente la tasa de fermentación tanto en el sake como en las cepas de laboratorio. La interrupción del gen Swi6, un coactivador transcripcional responsable de la transición G1 / S mediada por Cln3p, también resultó en una tasa de fermentación menor, mientras que los mutantes whi exhibieron una mejora significativa en la tasa de fermentación, lo que demuestra un papel positivo de Cln3p y su vía de señalización descendente en la facilitación de la fermentación de etanol.  

Materiales

Las cepas de levadura del sake Kyokai y cepas BY4741, BY4742, BY4743, BY4743 Δcln3, Δswi6 BY4743 y BY4743 Δwhi5. La disrupción de los genes Cln3 o Swi6 en K7 se realizó utilizando un método basado en PCR.

Proceso

 Las células de levadura se cultivaron a 25 ° C en medio líquido YPD a continuación, se fijaron. La triple tinción de manoproteínas de la pared celular de levadura, utilizando fluoresceína con concavalina A conjugado con isocianato, de la actina, utilizando rodamina-phalloidi, y de ADN nuclear, usando 4'-6 '-diamidino-2-fenilindol se llevó a cabo como se ha descrito previamente. Las células se observaron bajo el microscopio fluorescente, y las imágenes microscópicas se procesaron automáticamente usando el sistema CalMorph. Se analizaron y caracterizaron, para cada experimento, los fenotipos de más de 200 células individuales. Se realizaron, cinco (para cada cepa sake) o diez (para X2180), experimentos independientes y los 501 valores de los parámetros se calcularon automáticamente para cada experimento. El análisis de componentes principales se realizó utilizando Statistica software.

-Tests de fermentación: Las células de levadura se precultivaron durante la noche en medio YPD a 30 ° C, se inocularon en un medio YPD y fueron entonces incubadas adicionalmente a 30°C durante 5 días sin agitación. La fermentación se controló midiendo el volumen de dióxido de carbono producido. Finalmente se midió el tamaño celular y la densidad.

-Análisis de la citometría de flujo: Las células de levadura equivalente a 2 unidades de DO660 se cosecharon, se fijaron, se lavaron, y se suspendieron en 1 ml del tampón. La suspensión celular se mezcló con 12,5 microlitoros de 100 mg / ml de ARNasa A, se incubó a 50 ° C durante 60 min, se mezcló con 50 microlitros de proteinasa K y se incubaron adicionalmente a 50 º C durante 60 min. Después de la centrifugación, las células se suspendieron en 1 ml de 16 mg / ml de yoduro de propidio (Sigma) en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y se incubaron a 4 ° C durante la noche en la oscuridad. Esta suspensión de células (300 l) se mezcló con 600 microlitros de 8 mg / ml de yoduro de propidio en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y se analizó utilizando un citómetro Epics Elite ESP.

-Ensayo de PCR en tiempo real: El ARN total fue aislado de las células de levadura utilizando el RNeasy Mini Kit y se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (LMS). El cDNA fue sintetizado a partir de 50 ng de ARN total en un volumen final de 20 micorlitros utilizando el equipo RT PrimeScript de reactivos. La mezclas de PCR contenían cDNA , 0,2 micomolar de cebadores y SYBR Premezcla Ex Taq. La PCR cuantitativa en tiempo real específica de genes (qRT-PCR) se realizó usando un LightCycler (Roche), y la expresión de datos se procesó mediante el método de la segunda máxima derivada de la versión del software LightCycler 3,5. El ciclo umbral delta ΔCT se calculó restando el CT del gen ACT1 de la CT del gen CLN3. El valor de ΔΔCT se calcularon restando la ΔCT de la muestra X2180 en fase I de la ΔCT de las muestras individuales. Los doble cambios se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCT (40).


Resultados

Ø  CallMorph



En esta grafica se observan los resultados obtenidos con CallMorph (cada punto corresponde a un experimento) y se aprecia como las cepas de levadura de sake tienen rasgos comunes y la cepa de laboratorio es distinta.


Algunos de los resultados obtenidos más característicos son las yemas y las células de menor tamaño en las cepas de sake que en la de laboratorio, o una mayor proporción de células con yema en las cepas de sake que en X2180.
Observaron  26 nuevos rasgos morfológicos que servirán para buscar nuevas cepas con alta tasa de fermentación.



Ø  RT-PCR


Como se aprecia en la gráfica, gracias a la RT-PCR se observó una mayor presencia del producto de CLN3 en K7 que en X2180








Ø  Disrupción del gen CLN3 y Δswi6


Cuando se produjo la rotura del gen CLN3 y de uno de sus elementos reguladores Δswi6, se pudo observar como la fermentación disminuyó considerablemente


Ø  Análisis del genoma

Analizando el genoma de las cepas de levadura de sake se observaron cuatro sitios mutados aguas arriba de la región promotora y dos polimorfismos no sinónimos en la secuencia de codificación del gen CLN3 en K7, cuya importancia es todavía desconocida.


Conclusión

Se ha detectado una morfología distinta en la levadura del sake y se ha identificado al gen CLN3 como un acelerador de la fermentación ya que se encuentra en mayor cantidad en las levaduras de sake (que tienen una mayor fermentación) que en las de laboratorio y su disrupción disminuye la fermentación.

Estos resultados proporcionan un ejemplo de modificación artificial de las propiedades fermentativas de la levadura por la alteración del gen CLN3, esta tecnología es ampliamente aplicable para el desarrollo y mejora de cepas de levaduras mejoradas en el ámbito de panadería, elaboración de la cerveza y en las industrias de biocombustibles.



Realizado por: Francisco Javier Álvarez, Diego Cuenca, José David Fernández, Dámaso Moreno y Esther Vílchez.

PRODUCCIÓN DE HIDRÓGENO POR RHODOBACTER SPHAEROIDES A PARTIR DE ACETATO

Autores del artículo: Jyumpei Kobayashi, Kazuaki Yoshimune,Tomoe Komoriya, y Hideki Kohno
Fuente: Journal of Bioscience and Bioengineering; VOL. 112 No. 6, 602–605, 2011
Autores del resumen: Pablo Caruana Santiago, Vicente Agulló García, Jose Juan Vicente Norte y Héctor Botella Valle.
Palabras Clave: Rhodobacter sphaeroides, Fermentación oscura, Fermentación Luminosa, Biohidrógeno, Acetato, Lactato.
Contexto:

Hoy en día el hidrógeno es una fuente de energía limpia y eficiente, y es una alternativa al los combustibles fósiles. Gracias al avance de las tecnologías en el campo de los biocombustibles se está viendo incrementado su uso.

Sin embargo hoy en día, la forma de obtener hidrógeno a partir de gas natural o de biomasa es bastante contaminante.

La producción biológica de hidrógeno es mucho menos dañina para el medio ambiente y más segura. Además con esta producción eliminamos restos orgánicos, de los cuales se aprovechan los ácidos orgánicos para generar esta fuente de energía.

Introducción al experimento:

La producción biológica de hidrógeno consta de dos fases, la fermentación oscura y la fermentación luminosa (o fotofermentación).

En la fermentación oscura se produce una fermentación de ácidos orgánicos por bacterias del género Clostridium (como Clostridium butyricum) además de Enterobacter aerogenes, E. cloacae, liberándose acetato y lactato. Estos microorganismos son muy usados debido a su producción eficiente de hidrógeno en condiciones anaeróbicas y en ausencia de luz.

En la fermentación luminosa Rhodobacter sphaeroides degrada estos ácidos derivados de la fermentación por Clostridium y produce hidrógeno en presencia de luz. Es bien conocida y usada la cepa Rhodobacter sphaeroides RV por su alta producción de hidrógeno, especialmente a partir de lactato.

Experimento:

Nos centramos en el artículo Efficient hydrogen production from acetate through isolated Rhodobacter sphaeroides en el cual los investigadores buscan un productor de hidrógeno con un rendimiento de producción de hidrógeno elevado, en un medio rico en acetato y lactato proveniente de la fermentación oscura. Rhodobacter sphaeroides RV no aprovecha de manera tan eficiente el acetato como el lactato, por tanto el productor de hidrógeno que buscamos debe aumentar su rendimiento frente a este ácido orgánico.

Metodología:

Para ello aislaron bacterias de lagos y pantanos de las áreas de Tokio y Chiba, en Japón, y midieron su producción de hidrógeno.
El método empleado para aislar las bacterias fue el siguiente:
1-Se cultivaron a 30 oC las bacterias aisladas durante 2 semanas en un cultivo enriquecido con una solución inorgánica, una solución vitamínica, CaCl2·2H2O, MgSO4 ·7H20, K2HPO4, KH2PO4, con acetato sódico y extracto de levadura, bajo iluminación y en presencia de nitrógeno gas.
2-Se cultivaron a 30 oC las bacterias en un medio aSy: enriquecido con succinato sódico, extracto de levadura, sulfato amónico, bajo condiciones aeróbicas, en la oscuridad durante 2 semanas.
3- Una colonia proveniente del medio anterior fue aislada y cultivada en un medio aSy bajo iluminación y con un pH ajustado a 6,8.
4- Las bacterias aisladas fueron determinadas por su rRNA 16S.


El método empleado para producir el hidrógeno fue el siguiente:
1-Las bacterias fueron cultivadas en un medio aSy a 30 oC, bajo iluminación y en condiciones anaeróbicas.
2- Una colonia fue subcultivada en un tubo de 20ml durante 3 dias.
3- Las bacterias fueron cultivadas en una botella de Roux de 500 ml durante 3 días.
4-Las células fueron centrifugadas y resuspendidas en un medio basal.
5- Un 4% de agar a 60 oC fue añadido a la suspensión, enfriado y almacenado en una botella de Roux de   200 ml colocada horizontalmente
6-El hidrógeno fue producido en un medio de producción de hidrógeno a pH 7.0, medio basal con un tampón fosfato, ácido orgánico (lactato o acetato) y glutamato sódico a 30 oC, bajo iluminación.
7- El hidrógeno producido fue recolectado en un cilindro de medida con hidróxido sódico para atrapar el CO2

Resultados:

Se calculó el rendimiento de la producción de hidrógeno conforme a la cantidad de ácidos orgánicos que han sido consumidos.
Los resultados fueron los siguientes:
Se encontraron 5 bacterias con una alta producción de oxígeno y se compararon entre sí:




Como vemos destaca una cepa, la cepa HJ, con una producción de hidrógeno por lactato similar a la de la cepa RV pero con una producción de hidrógeno por acetato muy superior, aproximadamente 1,51 veces la de la cepa RV.


Se comparó la producción de hidrógeno de ambas cepas en presencia de acetato (durante varios días) y se obtuvieron las siguientes gráficas:


Como se puede observar la producción es superior en la cepa HJ.


Se hizo lo propio en presencia de lactato:


Se observa que es ligeramente superior.


Se obtuvo por tanto el rendimiento de ambos procesos y se compararon:


Rhodobacter sphaeroides Hj tiene un rendimiento de 2,5 moles por cada mol de acetato y un ratio de los rendimientos de acetato/lactato de 0,68 cuando en la cepa RV era de 0,40.

Todos estos resultados se observan en esta gráfica, conclusión final del experimento.





Conclusión:

Los resultados sugieren diferencias en las rutas metabólicas de R. sphaeroides, por tanto, futuros análisis pueden revelar enzimas clave en la producción eficiente del hidrógeno. Un estudio de recombinación genética de estas enzimas podría incrementar aún más la producción de hidrógeno en R. sphaeroides en un futuro.

Con este experimento se ha descubierto la cepa R. sphaeroides HJ, una cepa útil y eficiente para la producción biológica de hidrógeno.

Futuro:

Estudiar la mecánica enzimática que lleva a cabo este proceso e identificar los genes que codifican estas enzimas, así, mediante recombinación genética se podrán conseguir enzimas más eficientes en cuanto a la producción de hidrógeno por mol de sustrato, incrementando la producción y abaratando costes para hacer viable el consumo de hidrógeno en un futuro.

Referencia bibliográfica:
Journal of Bioscience and Bioengineering; VOL. 112 No. 6, 602–605, 2011

Jyumpei Kobayashi, Kazuaki Yoshimune,Tomoe Komoriya, y Hideki Kohno

Enlace:


                                                                                                                                                                           
Realizado por:

Pablo Caruana Santiago, Vicente Agulló García, Jose Juan Vicente Norte y Héctor Botella Valle.

martes, 28 de mayo de 2013

Nuevo método para la producción a gran escala de PG-CNP37, un análogo de péptido natriurético del tipo C


(A novel method for the large-scale production of PG-CNP37, a C-type natriuretic peptide analogue)
Autores: Shinong Long, Daniel J. Wendt, Sean M. Bell, Timothy W. Taylor, Jean-Yves Dewavrin, Michel C. Vellard

Etiquetas:
CNP
Cuerpos de inclusión
CNP22
PG-CNP37
Ácido fórmico
TAFm


Introducción y contextualización

La acondroplasia (conocida coloquialmente como enanismo) es una enfermedad del grupo de trastornos que se denominan condrodistrofias u osteocondrodisplasias, que afectan a 1 de cada 2500 niños nacidos. Se trata de una de las causas más frecuentes en el acortamiento de huesos largos, manteniéndose constante la longitud de la columna vertebral, lo que proporciona esa característica morfológica al individuo afectado. Las causas se deben a mutaciones genéticas al azar en el 75% de los casos y el 25% restantes a desórdenes autosómicos dominantes (localizados en el receptor 3 del factor de crecimiento del fribroblasto, FGFR3), que generan anormalidades en la formación del cartílago.
Esta enfermedad no solo puede causar rechazo social, sino también desemboca en posibles complicaciones en la salud de la persona afectada, como hidrocefalia o pies zambos. Además, se ha demostrado que si ambos padres son acondroplásicos y tienen un hijo homocigoto para el gen mutante, su esperanza de vida apenas es de unas pocas semanas.
El estudio realizado por Shinong Long entre otros investigadores, en el artículo “A novel method for the large-scale production of PG-CNP37, a C-type natriuretic peptide analogue”, se basa en la síntesis económica a gran escala de un análogo de CNP (C-type natriuretic peptide), debido a la difícil y costosa producción de este. Tanto esta proteína como su análogo, el PG-CNP37, son un potente estimulador del crecimiento del hueso endocondral que produce mejoras en la actividad del FGFR3 (cuya mutación causa el desorden autosómico dominante ya descrito).
Para ello se emplean recombinantes de Escherichia coli, en los que el problema de degradación por las diversas proteasas se resuelve gracias al embalaje de la proteína recombinante expresada en cuerpos de inclusión. Todo ello ha supuesto un método de producción de alto rendimiento sencillo, donde se obtienen 0,5 g al 95 % de pureza de PG-CNP37 por litro de cultivo del reactor estándar.

Procedimiento y resultados
Para llevar a cabo el experimento se siguieron los siguientes pasos:

1.      Clonación de las proteínas de fusión TAFm-PG-CNP37 y expresión en E coli.
El gen de la proteína PG-CNP37 y el del dominio mutado de histona del factor de transcripción humano TAF12 (TAFm), se fusionaron para expresarlos como cuerpos de inclusión. Para ello, los residuos de ácido aspártico en TAF12 se cambiaron por ácido glutámico, evitando la ruptura con el ácido fórmico y una cisteína por alanina para evitar la formación no específica de enlaces disulfuro. Esta proteína de fusión se clonó en un vector de expresión transformado en E. coli BL21. A continuación se sembró en placas de agar LB con kanamicina (antibiótico utilizado para seleccionar las bacterias que han incorporado el vector de las que no), y cuando se alcanzó una absorbancia a 600 nm de 0,6, se añadió al medio celular IPTG (un inductor de la traducción de las proteínas recombinantes). Por último, mediante centrifugación se recolectaron los sedimentos celulares, que posteriormente fueron lisados.

2.      SDS-PAGE y método Western para la detección de la expresión de TAFm-PG-CNP37
El lisado total celular (sobrenadante y sedimentos) se separó por SDS-PAGE y analizó  mediante el método Western blot: la proteína fue transferida a una membrana de nitrocelulosa en I-Blot (Invitrogen), previamente bloqueada con leche desnatada al 5% en tampón TBS-T Para la inmovilización de la proteína buscada se emplearon anticuerpos policlonales, anti-CNP22 de  conejo. Por último, se visualizaron con 10 mL de Blue Western Stabilized Substrate. Los resultados obtenidos se muestran a continuación:

Como se observa en la imagen, la gran mayoría de las proteínas fusionadas se encuentran en el lisado celular inducido con IPTG y en el Pellet (sedimento). El tamaño de la banda correspondiente a TAFm-PG-CNP37 es de 16 kDa: esto indica que se ha expresado como cuerpos de inclusión.

3.              Purificación de los cuerpos TAFm-PG-CNP37 y escisión con ácido fórmico.
El precipitado celular se resuspendió en tampón, se sonicó en hielo y se centrifugó a 2000 rpm durante 20 min a 4ºC. A continuación se resuspendió en tampón diluido y se repitió el proceso unas 3-5 veces hasta que el sobrenadante se volvió nítido. Se transfirió 1 mL de sobrenadante a tubos de 1,5 mL y se centrifugó a 14000 rpm durante 15 min. Se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se disolvieron en 500 µL de ácido fórmico a distintas concentraciones (50%, 10% o 2%) y temperaturas (25-70 C).

Analizando los resultados obtenidos, se observa que el mayor rendimiento era a 70 C durante 24 h, pero se obtenían productos no específicos, que hacían difícil la purificación mediante técnicas estándar de cromatografía. Por tanto, las condiciones seleccionadas para la escisión de los cuerpos se daban con una concentración al 2 % de ácido fórmico, a 55ᵒC y durante 24 h. En esas condiciones, la mayoría de las PG-CNP37 fueron separadas de las TAFm, obteniendo una banda del tamaño esperado.
 Por último, se neutralizaron los productos del corte con NaOH hasta alcanzar un pH 7 y se realizó el ensayo PAGE-SDS y LC/MS.

4.      Ensayo LC/MS
La elución de los péptidos se consiguió mediante un gradiente creciente de acetonitrilo, en presencia de agua y ácido trifluoroacético (0,05%). Los resultados del ensayo LC/MS confirmaron que la fracción soluble era principalmente PG-CNP37, mientras que la fracción insoluble estaba compuesta por TAFm y TAFm-PG-CNP37 no hidrolizado.

5.      Producción y purificación de PG-CNP37
Las células BL21 transformadas con el plásmido se cultivaron en un fermentador, obteniendo 8-10g/L de TAFm-PG-CNP37. El precipitado celular se resuspendió en un tampón salino de fosfato y se procedió a lisar el precipitado con un homogenizador de alta presión. El lisado resultante se llevó a centrífuga a 6500g durante 10 minutos y se le añadió ácido fórmico al 2% (para llevar a cabo la reacción de corte) al precipitado que contenía los cuerpos de inclusión insolubles. Tras otra centrífuga a 6500g durante 15 minutos, se obtuvo el producto de corte, PG-CNP37, en un 80 % de pureza, con una pérdida mínima por desnaturalización (fracción soluble). Mediante cromatografía de intercambio aniónico a un pH 7-7,2 (pI=10), se filtró el sobrenadante. Por último, se purificó el análogo mediante cromatografía de intercambio catiónico, utilizando como eluyente un ácido débil, obteniendo el péptido en agua acidificada. La obtención final de producto fue de 0,5 g/L con una pureza al 95%.


6.      Ensayo de actividad (ensayo in vitro basado en células)
Se cultivaron fibroblastos NIH3T3 de ratón y se trataron con concentraciones crecientes de CNP22 (proteína nativa) y PG-CNP37 (análogo). Se utilizó la producción de GMPc como lectura de la actividad de NPR-B (receptor B del péptido natriurético), expresado endógenamente en los fibroblastos. Cada concentración se analizó por duplicado. Tras la lisis de las células, para el ensayo de detección del punto de captura del GMPc, se obtuvieron actividades in vitro similares para ambos productos.

Conclusión
En este artículo se presenta un método sencillo y económico para la síntesis de un análogo del péptido natriurético C (CNP), PG-CNP37. CNP, debido a su escaso tamaño, es fácilmente hidrolizado por las proteasas de la célula. Para evitar la rápida degradación, este grupo de investigación procede a la expresión en E. coli de una proteína de fusión de mayor tamaño en cuerpos de inclusión y, posteriormente, a la escisión con ácido fórmico para liberar PG-CNP37 del compañero de fusión. Consiguen un rendimiento de 0,5g/L al 95% de pureza.
Las ventajas que presenta este método frente a otros son, en primer lugar, la escisión de la proteína de fusión con ácido fórmico, minimizando el elevado coste que supondría un método enzimático o la toxicidad e inespecificidad derivadas del uso de CNBr. Por otro lado, la expresión en cuerpos de inclusión del análogo PG-CNP37 supone las mismas ventajas que la producción extracelular (reducción de la proteólisis, simplificación de la producción), además de incrementar considerablemente la producción.  Para finalizar, este método también tiene como ventajas el ser un proceso simple y barato y el trabajar con una especie genéticamente muy estudiada y conocida, E. coli, cuyo rápido crecimiento en cultivo permite diseñar procesos de fermentación a gran escala.
  

Bibliografía
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/001577.htm

Growth and poliovirus production of Vero cells on a novel microcarrier with artificial cell adhesive protein under serum-free conditions (Aida Costa, Julia Carrillo, Sergio Navarro, Andrés Marco, Adrián Lázaro).

PRODUCCIÓN DEL POLIOVIRUS POR CÉLULAS VERO EN UN NUEVO MICROPORTADOR 

Autores del artículo: Masato Kurokawa y Shigehiro Sato.

Palabras clave: poliovirus, células Vero, microportador, DSAP, tasa de infectividad.

Contexto:

La poliomielitis  es una enfermedad contagiosa, producida por el virus de la polio, que afecta principalmente al sistema nervioso. Se transmite de persona a persona a través de secreciones respiratorias o por la ruta fecal-oral.
La mayoría de las infecciones son asintomáticas, pero el virus puede entrar al sistema nervioso central por la corriente sanguínea, destruyendo las neuronas motoras y causando debilidad muscular y parálisis flácida aguda. Es una enfermedad muy infecciosa, pero se ha erradicado en la mayor parte del mundo gracias al empleo de dos tipos de vacuna.
La primera consiste en una dosis inyectada de poliovirus inactivados o muertos (IPV), mientras que la segunda consiste en el uso de poliovirus vivos atenuados (OPV). Los virus son cultivados en células huésped llamadas “células Vero”, provenientes de tejido epitelial renal de mono. La OPV es mejor para prevenir la transmisión de la enfermedad a otras personas pero puede provocar la propia poliomielitis, por lo que es más recomendable la IPV.
Introducción:
El experimento consiste en el crecimiento y la producción del poliovirus por células Vero en un nuevo microportador, usando un polímero poliacrílico superabsorbente y uniendo PnF, una proteína celular adhesiva artificial sintetizada por Escherichia coli mediante ingeniería genética, y bajo condiciones de suero libres.

Los microportadores consiguen un aumento de la superficie y están constituidos por dextrano  y poliestireno. El dextrano es un polisacárido que se presenta hinchado por su propiedad absorbente de agua. Sin embargo, el uso de un polímero poliacrílico aumenta dicha absorción, consiguiéndose un tamaño medio de partícula de 250μm.

El dietilaminoetil (DEAE) y el colágeno son modificadores de superficies para microportadores, haciendo más eficiente el crecimiento. El DEAE carga positivamente la superficie aumentando la atracción y el colágeno incrementa la adhesión. No obstante, el colágeno es una sustancia de origen animal que puede originar contaminación por patógenos. Cytodex 3, un compuesto de perlas de dextrano recubiertas con colágeno porcino, se utilizó como el microportador control. Dentro de las proteínas celulares adhesivas no derivadas de animales, útiles para el crecimiento celular en un medio de suero libre, PnF era especialmente superior frente al resto de proteínas recombinantes.

Métodos para el cultivo de células y la producción del virus:

Tras la obtención de DSAP (DEAE unido al polímero superabsorbente) y de DSAP-PnF se prepararon 3 medios de cultivo: VSP-SFM (suero libre) y microportadores de DSAP; VSP-SFM (suero libre) y microportadores de DSAP-PnF; VSP-SFM (suero libre) y microportadores de Cytodex 3 como control.

Posteriormente, las células se incubaron mientras se agitaban a 30 rpm durante 8 días. En el día 6 del cultivo, la mitad del medio se intercambió por medio nuevo. En los días 2, 4, 6, y 8 se realizó una observación microscópica de las condiciones celulares sobre microportadores y una determinación del número de células. El recuento se realizó con un hemocitómetro, una vez el núcleo de las células había sido teñido con violeta cristal (CV) y con azul tripano (TB), obteniéndose los mismos resultados para las dos tinciones. Al día 8 el virus de la polio se inoculó en el cultivo y se continuó su incubación hasta los días 12 y 16, días en los que se extrajeron alícuotas que se congelaron hasta su uso.

Resultados:

Optimización de la densidad PnF:

El número de células Vero se midió tras la incubación durante 6 días, en la que se empleó DSAP y PnF-DSAP con diferentes cantidades de PnF (Fig. 1). El número de células tendía a aumentar con el incremento de  la concentración de PnF en la superficie de los microportadores, alcanzándose una meseta alrededor de 1 μg/cm2.

Figura 1:

Caracterización de microportadores:

Se evaluaron las propiedades físicas de DSAP y PnF-DSAP, utilizando Cytodex 3 como microportador control. Los primeros se obtuvieron a partir de un polímero poliacrílico superabsorbente mientras que el segundo se obtuvo a partir de dextrano. La densidad de partícula, el diámetro y el potencial zeta eran similares. No obstante el volumen de absorción testado mediante un hinchado con solución salina fue mayor con DSAP y PnF-DSAP, como se observa en la siguiente tabla.


Además se visualizó la presencia de PnF en PnF-DSAP con el anticuerpo fluorescente monoclonal anti-PnF. Se concluye que PnF-DSAP generó mayor fluorescencia a medida que aumenta la densidad PnF.



El crecimiento celular y la producción de virus:


Se utilizó PnF-DSAP y Cytodex 3 para la medición del número de células Vero en los días 2, 4, 6 y 8 de incubación. Los resultados se muestran en la figura 4. No hubo una diferencia significativa en el número de células entre los dos cultivos de microportadores en el día 2 de incubación. Sin embargo, fue significativamente mayor en el cultivo con PnF-DSAP que con Cytodex 3 en el día 4 y posteriores.
Las imágenes de cada microportador obtenidas con un microscopio de inversión en los días 2, 4, 6 y 8 de incubación se muestran en las Figs. 5 y 6 (PnF-DSAP y Cytodex respectivamente).

                                 Figura 5:                                     Figura 6:


A partir del día 12 de incubación las células empezaron a lisarse como consecuencia del crecimiento vírico (fig. 5 y 6). Los resultados de la producción del virus de la polio se muestran en la Tabla 2. La tasa de infectividad del virus de la polio con PnF-DSAP fue mayor que con Cytodex 3 en un 40% aproximadamente en el día 12 y en un 30% en el día 16.


Discusión:

Para la fabricación de vacunas contra la polio y otras enfermedades se solían utilizar cultivos de microportadores en medio con FBS (suero bovino fetal). No obstante, en los últimos años se ha recurrido a suero exento de derivados animales. Además, los microportadores comúnmente utilizados (como Cytodex 3) están siendo sustitui0scn dos por nuevos modelos. Comparando el microportador propuesto con Cytodex 3 observamos las siguientes ventajas:

-El uso de un polímero poliacrílico superabsorbente en un microportador aumenta el tamaño de partícula y en consecuencia la superficie de cultivo.

-Se observó una mejora del crecimiento de las células Vero por la presencia de PnF en los microportadores, puesto que la forma de la célula es controlada por la densidad de PnF.

Estos hallazgos sugieren que los PnF-DSAP aportan una mayor superficie de cultivo a la vez que reducen el área de adhesión necesaria para el desarrollo individual de una célula Vero en comparación con Cytodex 3. Todo ello se traduce en una mayor productividad celular e infectividad del poliovirus.

En vista de estos resultados podemos concluir que los investigadores han desarrollado un microportador para el desarrollo de vacunas más eficiente que Cytodex 3, siendo el medio de cultivo utilizado suero libre de compuestos animales.

Referencias bibliográficas:

-         Wikipedia.

-         CDC (centro de control y prevención de enfermedades).

-       “Med line plus”.

-         Artículo sobre el poliovirus “Growth and poliovirus production of Vero cells on a novel microcarrier with artificial cell adhesive protein under serum-free conditions”.