Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


También podrás encontrar diversas páginas y blogs relacionados con el mundo de la Microbiología. El material que se presenta en ellos puede ser utilizado en clase.


sábado, 21 de mayo de 2016

Biomineralización de oro en biofilms de Cupriavidus metallidurans: Historia de una bacteria que vale oro

Una de las preguntas que uno puede plantearse es: ¿Hasta dónde pueden llegar las aplicaciones de los microorganismos? Sabemos que éstos son utilizados en numerosas actividades industriales, como son la producción de alimentos y medicamentos, e incluso la extracción de metales. En esta última aplicación nos encontramos con Cupriavidus metallidurans, una bacteria con la sorprendente capacidad de precipitar oro presente en disolución (soluble) en su forma mineral (insoluble) por un proceso de biomineralización en biofilms, es decir, puede solidificar el oro en disolución cuando convive con otros microorganismos, ya sean de la misma especie u otra distinta (como Delftia acidovorans, que también bioprecipita el oro pero lo hace con una sustancia especial, la delftibactina).

Nanopartículas (flecha azul) y complejos de oro (flecha roja). Fuente

C. metallidurans con una partícula de oro en el periplasma. Fuente


Al leer esto, puede pensar si es posible hacerse rico consiguiendo una de estas bacterias, pero esto no es tan fácil: C. metallidurans solo permite obtener una concentración extremadamente pequeña de este metal precioso a partir de una disolución de oro, y tampoco se sabe con certeza si su aplicación en un proceso industrial podría ser rentable o no, en comparación con la consolidada y contaminante industria del oro, que utiliza compuestos de cianuro para su extracción.

De momento, los experimentos recientes indican que la obtención de biominerales de oro por precipitación de complejos de oro en disolución con C. metallidurans es eficiente, además de que el proceso bacteriano favorece la detoxificación o eliminación de metales pesados que resultan tóxicos para los microorganismos y contaminan el medio. Debido a la disposición de las bacterias resistentes en biofilms, es posible acumular una gran cantidad de metales sin que éstos resulten perjudiciales.

En la composición de estos biofilms, destacan unas sustancias denominadas EPS (Extracellular Polymeric Substances), que favorecen el desarrollo del biofilm, permitiendo la adhesión a superficies, la agregación celular y la protección frente a condiciones tóxicas.

Biofilm con partículas esferoidales de oro metálico. Fuente

En relación al estudio realizado, éste puede llegar a resultar complejo de entender, pero simplemente se basa en demostrar lo siguiente:

  • La capacidad de los biofilms viables de C. metallidurans de precipitar partículas de oro metálico, en presencia de complejos de Au (I).
  • La mayor eficiencia en la conversión de oro en biofilms viables que en controles estériles y abióticos, es decir, sin microorganismos.
  • La obtención de biominerales de oro similares a los granos de oro naturales.


Para ello, se analizó la retención de oro en distintas situaciones. Con biofilms viables, en los que se inocularon los microorganismos y se dejaron crecer, se retuvo oro en más de un 99% en peso, como consecuencia de la acción biomineralizadora de éstos. En cambio, tanto en medios estériles, que fueron expuestos a las bacterias y esterilizados posteriormente, como en medios abióticos, en los que no se inocularon las bacterias, se retuvo menos de un 30% en peso, después de un mes de incubación. Todo esto se traduce en que C. metallidurans, organizado en biofilms, podía bioprecipitar el oro soluble de un modo eficiente y, con ello, acumularlo en determinadas zonas del biofilm.

A medida que se produce la biomineralización, tiene lugar un hecho curioso, denominado efecto nugget. Éste se basa en la afinidad que tienen las partículas de oro para formar agregados, lo que finalmente origina la encapsulación y reemplazo de las bacterias.


Retención de oro en biofilms viables y en medios control (estériles y abióticos). Fuente

Segmento de 20 mm de un biofilm de C. metallidurans, en el que el oro se distribuye en función de la actividad microbiana: El oro se concentra en zonas con elevada actividad microbiana. Fuente


El uso de este tipo de microorganismos resistentes a los metales pesados tiene numerosas aplicaciones en biominería. Un claro ejemplo es BioSigma que, creada por Codelco, se dedica a la biolixiviación de cobre (proceso contrario a la biomineralización).

Además, pueden ser utilizados en biorremediación. En la explotación minera de cobre, plata y oro, se libera mercurio al medio ambiente, por lo que estos microorganismos pueden ayudar a conseguir una minería sostenible.

En definitiva, solo queda esperar y ver si el proceso industrial de Cupriavidus metallidurans realmente puede valer oro o se queda en el intento.


Trabajo realizado por

Ana María Aguilar García
Óscar Herrera Chacón
Jesús Hurtado Tamayo
César Martínez Guardiola
Álvaro Más Martínez de Tejada
Fabio Mucci Lozano


Bibliografía

Fairbrother L, Etschmann B, Brugger J, Shapter J, Southam G, Reith F.

Biomineralization of gold in biofilms of Cupriavidus metallidurans

Environmental Science & Technology. 2013 Mar 19;47(6):2628-35. doi: 10.1021/es302381d

jueves, 19 de mayo de 2016

Biolimpieza de alteraciones de nitratos en las pinturas murales mediante Pseudomonas Stutzeri

 

Pilar Bosch Roig , Jose Luis Regidor Ros, Rosa Montes Estellés
Instituto Universitario de Restauración del Patrimonio IRP, Área de Microbiología, Departamento de Biotecnología Universitat Politècnica de Valencia
Publicado en el “International Biodeterioration and Biodegradation”

Realizado por: Eloy Mora Navarro, Sheila Romero Carretero, Yaiza Senent Valero, Jessica Solis Villalva y Pablo Sosa Domínguez.
 


Eflorescencia en una pintura. Fuente
Uno de los mayores problemas a los que se enfrentan las obras de arte de interior es la formación de eflorescencias, es decir, la formación de cristales de sales, generalmente de color blanco, que se depositan en la superficie de dichas obras de arte. La acumulación de estas sales ejerce una presión sobre la pared creando micro-fisuras en la pintura. Estas sales no se pueden eliminar fácilmente, por lo que se emplean métodos físico-químicos, aun siendo ineficaces por ser agresivos, invasivos y no selectivos.

Actualmente se ha descubierto que algunos microorganismos pueden emplearse para la conservación y restauración. Estos microorganismos no son patógenos por lo que no presentan ningún riesgo para el trabajador. Como iremos viendo a continuación, la biolimpieza puede ser una opción muy eficaz para la restauración ya que nos proporciona numerosas ventajas. 
 

Comparativa entre los métodos convencionales y la biolimpieza.


En este trabajo se muestra el uso de la biolimpieza de eflorescencias de sales de nitratos en murales mediante el uso de Pseudomonas stutzeri. El objetivo de esta investigación era encontrar un método biológico alternativo de limpieza de eflorescencias de sal; en este caso, eflorescencias presentes en las pinturas al fresco y murales de la iglesia de los Santos Juanes en Valencia, España.


 
 
 
 


Morfología de diferentes colonias de P. stutzeri. Fuente

Antes de realizar el experimento en la propia pintura, se analizó mediante métodos físicos y químicos una micromuestra. Mediante las técnicas basadas en el uso de infrarrojos y de Rayos X se pudo determinar que la composición principal de las eflorescencias del mural de la iglesia de los Santos Juanes era nitrato de potasio. Llegados a este punto era necesario encontrar la cepa más adecuada para la eliminación de estas eflorescencias de nitrato potásico. Para ello, se probaron una gran cantidad de cepas bacterianas en el laboratorio para comprobar cuál de ellas reducía mejor estos nitratos hasta nitrógeno gas. 

Para ello, se realizó, en el laboratorio, una simulación de la pintura con eflorescencias en las condiciones en las que se encuentran los murales de las paredes de la Iglesia los Santos Juanes. Para ello se emplearon materiales de piedra a los que se le aplicaron capas de pintura para generar sal eflorecida. Recreando así, las condiciones en las que las bacterias debían actuar en los Santos Juanes.

Proceso de reducción de nitrato a nitrógeno gas. Fuente
Para eliminar las costras de sal de la superficie del mural se usaron bacterias reductoras de nitratos, las cuales son capaces de convertir los nitratos hasta nitrógeno gas.

Una vez análizadas varias bacterias durante 48 horas en un
medio de cultivo líquido rico en nitratos, se observó que las cepas de P. stutzeri DSMZ 5190 y CECT 930 eran las que mejor resultado mostraban en la reducción de nitratos, pues eran capaces de reducir el nitrato a nitrógeno molecular sin producir nitritos (sustancia tóxica) como intermediarios.

Ante la disyuntiva de elegir entre estas dos cepas, se comprobó el rendimiento de cada una. Para ello se colocaron las dos cepas en las mismas condiciones experimentales (igual material o soporte y cantidad de eflorescentes), así se observó que DSMZ 5190 es capaz de reducir el doble de nitratos que CECT 930. DSMZ 5190 es, por tanto, la bacteria más eficiente para la eliminación de las eflorescencias salinas de las paredes de la iglesia.

Tras comprobar la efectividad de la cepa para la eliminación de eflorescencias, se realizaron diversas simulaciones en el laboratorio para evaluar que método de aplicación era el más apropiado, además de para precisar las condiciones del método y el tipo de soporte idóneo para que las bacterias alcancen su nivel óptimo de acción. Para la elección del soporte se probaron cinco diferentes, para ver cuál era el óptimo:
algodón hidrofílico, sepiolita, carbogel (CTS), agar bacteriológico europeo y agarosa. Estos soportes se colocaron con papel japonés para evitar dañar la pintura (entiéndase ‘‘papel japonés’’ como un homólogo del papel vegetal que encontramos en cualquier cocina. Es un tipo de papel fino y resistente hecho de un tipo de flora local japonesa, de ahí su nombre)

En este trabajo se presenta por primera vez la aplicación de agar como soporte, resultando ser el mejor para la eliminación de las eflorescencias. Presenta una serie de ventajas frente a otros, como son: una limpieza homogénea de la muestra, al no producir marcas de agua y eliminar todos los residuos de la superficie de la muestra. Además, se trata de un soporte asequible y con importantes propiedades adhesivas que evitan los posibles desprendimientos de pared durante el tratamiento. Es importante destacar también que el agar proporciona la humedad adecuada para la acción óptima bacteriana. Además, estos soportes se colocaron con papel japonés para evitar daños, ya que proporciona una mayor protección a la pintura. Las pruebas de laboratorio también ayudaron a determinar que el tiempo óptimo de tratamiento para las eflorescencias es de 90 minutos.
Tras las simulaciones, se procedió a la aplicación de la cepa P. Stutzeri DSMZ 5190 siguiendo las pautas descritas en las paredes de los Santos Juanes. Después de 90 min de tratamiento se retira el agar, el papel japonés y la superficie tratada se limpia con agua estéril. Una vez que la superficie está completamente seca, se verificó que las eflorescencias salinas habían desaparecido casi por completo.

Investigadora aplicando una suspensión de bacterias sobre papel japonés en la
Iglesia de los Santos Juanes, Valencia.
Fuente
 
Para poder comparar la eficiencia del biotratamiento con bacteria respecto a otros tratamientos de limpieza, necesitamos conocer la cantidad de nitrato de potasio presente en la muestra antes de cualquier intervención y la cantidad de nitrato de potasio tras la aplicación de cualquier tratamiento de limpieza, tanto convencional, como en el caso de que se emplee la biolimpieza.

Mediante la
técnica de cromatografía iónica (catiónica) se puede cuantificar la cantidad de nitrato de potasio presente en cada muestra:

Comparativa de la cantidad de nitrato de potasio (sales) en diferentes condiciones.

Interpretamos de la gráfica que este resultado de 133,82mg/kg es muy similar a la cantidad de nitrato de potasio encontrado en pinturas murales sin eflorescentes salino (sanas) que es de 130,85 mg/Kg. Los resultados muestran que la eliminación de nitratos de potasio con la cepa de P. stutzeri 5190 DSMZ junto con agar, es decir, mediante biolimpieza, presenta una mayor tasa de eliminación de nitratos, con un 92%, en comparación con la eliminación por tratamientos convencionales que presenta una tasa de eliminación del 66.72%.

Otro aspecto importante de este experimento es la monitorización a corto, medio y largo plazo ya que nos permite garantizar que no se han quedado residuos de P.Stutzeri en la obra. En nuestro caso para la monitorización microbiana se usaron bioindicadores de la actividad bacteriana con el objetivo de verificar que no se produzca crecimiento microbiano una vez finalizado el tratamiento. 30 días después de finalizar el tratamiento, no se detectó crecimiento de microorganismos. El seguimiento de la eliminación de nitratos se hizo por análisis químico utilizando análisis mediante infrarrojo o cromatografía iónica. Es importante resaltar que para emplear métodos de biolimpieza en obras de arte, se debe evaluar caso por caso, ya que cada pintura mural es diferente y la sal de la corteza presenta sus propias características peculiares.

Del estudio realizado en la iglesia los Santos Juanes, concluimos que las condiciones experimentales (todo el proceso explicado con anterioridad) como los materiales utilizados (el agar como soporte) fueron los adecuados. Esto lo validan los resultados obtenidos. Además, la cepa seleccionada, P. Stutzeri, supuso un éxito dada su capacidad para eliminar los nitratos con tanta eficacia.
 
Imagen de la pintura antes y después de la biolimpieza. Fuente

Otro ejemplo de biolimpieza lo encontramos en la investigación sobre “Bacterias para biorestaurar y bioproteger el Patrimonio Artístico y Monumental de Ciudad Rodrigo “, realizada por Raúl Rivas y José David Flores, profesores e investigadores de la Universidad de Salamanca.

 La investigación ha evaluado la capacidad de cepas bacterianas, extraídas de las canteras y monumentos de Ciudad Rodrigo, para inducir la precipitación del carbonato cálcico. Estas bacterias podrían ser utilizadas en procesos de biorestauración, bioconservación, bioconstrucción y bioingeniería. .

El mejor resultado identificado han sido las bacterias del género Citricoccus y Arthrobacter, pues de entre todas las cepas analizadas eran las únicas que ofrecían buenos resultados sin alterar el color de la piedra, además de no ser patogénicas. El factor más analizado ha sido la capacidad las bacterias para integrarse con la roca sin producir ningún tipo de pigmento sobre los monumentos. Así, la actividad de las bacterias seleccionadas en esta investigación permite cerrar las fracturas y grietas de las rocas a nivel microscópico frenando el proceso de degradación.
 
Bacterias formando cristales de calcita. Fuente

Las bacterias no solo han permitido detener el proceso de degradación sino también reparar microfracturas mediante la precipitación de carbonato cálcico en forma mineralizada, “calcita”. Las bacterias crean una matriz que cohesiona la roca y que se integra perfectamente en la estructura del monumento, retrasando no solo el proceso de erosión sino también creando una película carbonatada protectora sin originar defectos estéticos indeseables.

Podemos concluir de estos estudios, que la utilización de microorganismos en el mantenimiento y restauración de monumentos y obras artísticas está siendo, cada vez más, una opción mejor considerada. Los microorganismos, hasta ahora, destructores de la creatividad, se colocan a disposición del arte.




Bibliografía

Pilar Bosch Roig, Jose Luis Regidor Ros, Rosa Montes Estellés
Biocleaning of nitrate alterations on wall paintings by Pseudomonas stutzeri
Instituto Universitario de Restauración del Patrimonio IRP, Universitat Politècnica de València, Área de Microbiología, Departamento de Biotecnología.
Volume 84, October 2013, Pages 266–274

Bosch-Roig P, Ranalli G
The safety of biocleaning technologies for cultural heritage
Front Microbiol. 2014 Apr 10;5:155. doi: 10.3389/fmicb.2014.00155. eCollection 2014.

Ranalli G, Alfano G, Belli C, Lustrato G, Colombini MP, Bonaduce I, Zanardini E, Abbruscato P, Cappitelli F, Sorlini C.
Biotechnology applied to cultural heritage: biorestoration of frescoes using viable bacterial cells and enzymes
J Appl Microbiol. 2005;98(1):73-83.