New method for isolating antibiotic-producing fungi

Autores: Mio Kawaguchi, Kenichi Nonaka, Rokuro Masuma y Hiroshi Tomoda.

Componentes del grupo: Abdelmonim Bernia, Nuria Castejón Navarro, Ainoa Gallego Zaragoza, Carlos Hernández Cortés y Niurka Martínez Morales.

Palabras  clave: Compuesto bioactivo,  metabolitos secundarios,  etnomicología, antifúngico, Candida albicans, inoculación.

    1.- INTRODUCCIÓN

Es bien sabido que los hongos siguen siendo una de las fuentes más importantes para el descubrimiento de  nuevos  compuestos  bioactivos.  De  la  historia  del  descubrimiento de  fármacos a partir de microorganismos, los metabolitos secundarios de los hongos han proporcionado un importante número de fármacos, tales como el antibiótico penicilina, el inmunosupresor c y los agentes antihipercolesterolémicos lovastatina y compactina.

La Etnomicología podría definirse como el estudio de los usos de los hongos por las diversas culturas; ya que los hongos son organismos  que  desde  siempre  han  sido  empleados  para  los  más diversos y extraños menesteres.

El cuerpo humano alberga normalmente una gran variedad de microorganismos que incluyen bacterias  y  hongos.  Entre  estos, algunos  son  útiles  para  el  cuerpo, otros  no  producen  ni  daño  ni beneficio y unos cuantos pueden provocar síntomas, a veces, dañinos. Este último, es el caso del microorganismo de interés: Candida albicans, que es una  levadura que  vive  en  casi todas partes, incluyendo el cuerpo humano. Se encuentra   normalmente en pequeñas cantidades en la vagina, la boca, el tubo digestivo y en la piel; y, por lo general, el sistema inmunológico mantiene los hongos bajo control.

Muchos de estos antibióticos han sido descubiertos a partir de microorganismos, por  un proceso que incluye varias etapas:

1) Aislamiento de microorganismos principalmente del suelo (2-3 días).

2) Purificación de los cultivos de los microorganismos aislados (3-5 días).

3) Identificación de los microorganismos aislados principalmente por características morfológicas para eliminar cepas duplicadas (14-21 días).

4) Comprobación   de si los caldos de cultivo o extractos de microorganismos que muestran actividad antimicrobiana para seleccionar microorganismos candidatos que produzcan antibióticos (7-8 días).

5) Resuspensión de los microorganismos seleccionados para obtener la reproductibilidad de la actividad antimicrobiana (6-8 días).

Este proceso rutinario (llamado en este estudio “método tradicional”) lleva normalmente 5-7 semanas. Lo que pretende este estudio es mostrar un método más eficiente y rápido para seleccionar los hongos que puedan producir antibióticos anti-Candida albicans.

     2.- MATERIAL Y MÉTODOS

Medios para el aislamiento de hongos

 

            Se usaron cuatro medios para el aislamiento de hongos de las muestras de suelo y se añadió kanamicina a todos para proteger las muestras contra el crecimiento de bacterias ajustados a pH 6,0 antes de la esterilización.

           En el método A las muestras de suelo se pusieron en una placa de plástico y cada uno de los cuatro medios se fundieron para ser vertido en las placas, mezclándose bien para dispersar la muestra; se produjo un rápido crecimiento de hongos como Trichoderma, Aspergillus y Penicillium inhibiendo el crecimiento de otros hongos.

           En el método B las muestras de suelo muy diluidas se suspendieron en tampón Winogradsky. Por este método de revestimiento se aislaron las colonias de hongos como las especies Virgaria y Humicola, de crecimiento lento.

           Ambos métodos fueron usados para preparar las placas de suelo que fueron incubadas a 27°C durante 2-3 días para formar colonias fúngicas.

           El  objetivo  fundamental  de  este  estudio  fue  observar  directamente  el  crecimiento  de  las colonias de hongos derivadas de las muestras de suelo que mostraban efectos antagónicos para el crecimiento de C. albicans.

 Inoculación de C. albicans en placas de suelo

           Se probaron para ello 5 métodos de inoculación de C. albicans:

   - En  el método I, C.  albicans y  la  muestra de suelo se  mezclaron e  incubaron al  mismo tiempo.

   - En el método II, C. albicans se preparó en primer lugar en un medio de agar; y la placa que contenía la muestra de suelo en agar se puso encima y se incubó a continuación.

           En estos dos métodos, C. albicans patógena y el hongo derivado del suelo, comenzaron a crecer al mismo tiempo obteniéndose, como resultado, un recubrimiento de la placa  con C. albicans (figura 1a) porque creció mucho más rápido que la muestra de suelo, los cuales no pudieron formar colonias. Ello supuso que no se pudieran observar efectos antagonistas en las placas.

   - En  el  método  III,  C.  albicans  se  extendió  en  las  placas  de  suelo,  después  de  que formasen  colonias  tras  2-3  días  a  27°C.  Desafortunadamente, C.  albicans  no  creció  de manera uniforme en la placa (figura 1b).

    - En el método IV, Las muestras de suelo se extendieron sobre la placa de C. albicans después estas últimas formaran colonias (2-3 días de incubación a 27°C); sin embargo, las muestras de suelo al crecer no quedaron repartidas de forma uniforme por la placa de C. albicans (figura 1c).

     Establecimiento del método de inoculación V

           Para establecer este método, se estudió la concentración de  C. albicans que debía poseer la suspensión para  pulverizar la  placa, así como el proceso de formación de  los derivados fúngicos del suelo.

           El atomizador usado en este estudio puede pulverizar una solución de 40 μl. Se probaron cinco concentraciones diferentes de suspensiones de  C.  albicans para pulverizar en la placa de suelo y se comparó el crecimiento de C. albicans después de 1-3 días de incubación a 27ºC.

           La figura 2 muestra que las colonias de C. albicans pulverizadas en la placa de agar (sin muestra de suelo), tras un día de la inoculación, crecieron rápidamente. Se puede deducir,  pues, que una incubación de un día era suficiente para que C. albicans pudiera formar colonias,  siendo las más adecuadas para el estudio las obtenidas en las placas (C) y (D).

      Más tarde, las placas del  suelo se  prepararon por el  método de  recubrimiento A o  B y se incubaron a 27ºC   y, después   de 2 o 3 días de incubación para formar las colonias,  la suspensión de C. albicans se pulverizó sobre las mismas, dentro de una bolsa de plástico instalada en la campana (figura 3). Tras un día de incubación a 27ºC, se seleccionaron las colonias que mostraban efectos antagónicos sobre el crecimiento de C. albicans (figura 4).

  Identificación taxonómica del hongo

         La identificación taxonómica se llevó a cabo mediante la observación de la disposición de los conidióforos y la forma en que se produjeron las esporas, y por el crecimiento del hongo en agar.

  Ensayo de la actividad anti-C.albicans

            Para confirmar la producción de antibióticos anti-fúngicos por cepas seleccionadas, se inoculó con un asa de siembra las cepas de LCA en un tubo de prueba que contenía uno de los medios (1-4). El tubo sería incubado en un agitador rotatorio a 27ºC durante 6 días. Posteriormente, se midió la actividad anti-C. albicans por el método de difusión en agar usando discos de papel.

3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN

             Se vio que la inoculación de C. albicans por los métodos I – IV no eran adecuados para el propósito final; por lo que, se ensayó otro método para superponer C. albicans en una placa de suelo por pulverización (método de inoculación V).

Taxonomía de las 26 cepas seleccionadas

     Los resultados de la taxonomía de las 26 selecciones, se observan en la siguiente tabla:

             En este estudio, se ha establecido un método eficaz y rápido para un aislamiento directo de hongos a partir de muestras de suelo que pueden producir antibióticos anti C. albicans. Para ello se dispersó por pulverización después de que las colonias derivadas del suelo se hubieran formado en las placas (en 2 o 3 días). Después de un día de incubación, se seleccionaron las colonias que mostraban un efecto antagónico en el crecimiento de C. albicans.

           De esta forma, en una semana, se seleccionaron 151 hongos candidatos de 18 muestras de suelo y, de entre ellos, 26 hongos mostraron actividad anti-C. albicans en sus caldos de cultivo.

           Como se resume en la tabla 1, Penicillium fue el género seleccionado que más antifúngico produce y fue el más aislado (16/26), seguido de Trichoderma (3/26).

           Por lo tanto, este método permite obtener productores de antibióticos de hongos procedentes del  suelo en un tiempo más corto (2 semanas vs.  5-7 semanas) y con una tasa mayor (17,2% frente a 3,1%) que el método tradicional.

4.-CONCLUSIÓN

             En este estudio se ha conseguido obtener un método más eficaz y rápido para el aislamiento de hongos con actividad antifúngica. Cabría esperar que este método sea aplicable para el aislamiento de microorganismos derivados del suelo (hongos y actinomicetos de rápido/lento crecimiento) que muestren efectos antagonistas en otros microorganismos patógenos.       

          Se obtendría así una optimización de los resultados en un periodo de tiempo más corto gracias a los avances científicos y tecnológicos; lo cual supondría un mayor aprovechamiento del tiempo en la resolución de problemas y/o búsqueda de tratamientos/soluciones a los mismos. Además de un mayor ahorro a la hora de mantener los cultivos.

Referencia Bibliográfica: The Jounal of Antibiotics (2013) 66, 17-21

“Effect of fermentation temperature on validamycin A production by Streptomyces hygroscopicus 5008”

Efecto de la temperatura de fermentación en la producción de Validamicina A por Streptomyces hygroscopicus 5008.

Artículo:  “Effect of fermentation temperature on validamycin A production by Streptomyces hygroscopicus 5008”
Publicado en la revista: Journal of Biotechnology número 142 del año 2009 (páginas 271- 274).
Autores: Yueqiao Liao, Zhen-Hua Wei, Linquan Bai, Zixin Deng, Jian- Jiang Zhong.

1.       INTRODUCCIÓN

En el este de Asia, existe una enfermedad en el cultivo de arroz llamado “tizón de la vaina” producido por un hongo. La validamicina A (VAL-A), producida por Streptomyces hygroscopicus es un importante agroantibiótico antifúngico. En este trabajo, el efecto de la temperatura de fermentación en la biosíntesis de VAL-A fue investigada entre 28˚C-42˚C, se concluyó que un rango interesante de temperaturas para esta producción se encuentra entre 35˚C-37˚C. Los tres operones, valABC, valKLMN y valG, para los ocho genes necesarios para la producción de validamicina A, fueron activados cuando la temperatura alcanzaba el umbral. La actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) de la ruta de las pentosas fosfato y ValG de la biosíntesis de Val-A fueron también mejoradas a una alta temperatura de cultivo.

La enfermedad  tizón de la vaina de arroz presenta la sintomatología hacia finales del ciclo del cultivo. Se produce el marchitamiento y secado de hojas quedando adheridas al tallo. Cuando el cultivo ya se encuentra senescente, se hace visible el signo del patógeno, representado por hileras de puntos negros sobre el tallo, que son los cuerpos de fructificación del hongo.

Rhizoctonia solani, el hongo causante de la enfermedad, puede sobrevivir en el suelo durante muchos años en forma de esclerocios. Los esclerocios de Rhizoctonia tienen gruesas capas externas que permiten la supervivencia y funcionan como la estructura de hibernación del patógeno. En algunos casos raros el patógeno también puede tomar la forma de micelio que reside en el suelo. El hongo es atraído a la planta por estímulos químicos liberados por la planta en crecimiento y/o el residuo de descomposición de la planta.

El proceso de penetración en un huésped se puede lograr de diferentes maneras. La entrada puede ocurrir a través de la penetración directa en la cutícula de la planta/epidermis o por medio de aberturas naturales en la planta. Las hifas entrarán en contacto con la planta y se unirán por medio del crecimiento, penetrando en la célula de la planta permitiendo al patógeno obtener los nutrientes.  El patógeno también puede liberar enzimas que descomponen las paredes celulares de la planta, y continúa para colonizar y crecer dentro del tejido muerto. Esta ruptura de las paredes celulares y la colonización del patógeno en el huésped es lo que forma el esclerocio. Un nuevo inóculo se produce en o dentro del tejido huésped, y un nuevo ciclo se repite cuando se dispone de nuevas plantas.

El ciclo de la enfermedad comienza  durante el invierno. El esclerocio/micelio se encuentra en los restos en descomposición de plantas, en el suelo o en plantas huéspedes.  Las hifas jóvenes y basidios en fructificación  emergen y producen micelio y basidiosporas.  La producción de basidiosporas en germinación penetran en el estoma mientras que el micelio se sitúa sobre la superficie de la planta y secreta las enzimas necesarias en la planta con el fin de iniciar la invasión de la planta huésped. Después de invadir con éxito al huésped, se forma necrosis y esclerocios en y alrededor del tejido infectado que entonces conduce a los diversos síntomas asociados con la enfermedad, tales como la pudrición del suelo y del tallo… y el proceso comienza de nuevo.

Validacin es un efectivo fungicida-bactericida de origen natural, cuyo ingrediente activo es la validamicina A, producida por Streptomyces hygroscopicus 5008. Inhibe la trehalasa,  una enzima presente en la mayoría de los seres vivos, pero que es inhibida con mayor efectividad en hongos. Esta inhibición bloquea la reacción que oxida la trehalosa en dos glucosas. Esto  afecta a la digestión y al transporte de glucosa a las puntas de las hifas, deteniendo su crecimiento, por tanto el micelio no puede afectar a la planta. Por un lado, al no producir glucosa se acumula la trehalosa, provocando el hinchamiento de las células por un efecto higroscópico (capacidad de algunas sustancias de absorber o ceder humedad al medio ambiente). Por otro lado, al no producirse glucosa, no se puede producir una sustancia que forma parte de la membrana (fosfatioinositol), con lo que ésta queda afectada y detiene el crecimiento de las puntas de las hifas.

2.       MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo y análisis de fermentación

Las esporas de S. hygroscopicus 5008 fueron almacenadas, activadas y cultivadas para luego ser recogidas en seis duplicados, uno para cada condición de temperatura.

Para determinar la concentración de proteína intracelular, se centrifugó el micelio, se lavó y luego se distribuyó a dos tubos Eppendorf, añadiendo lisozima a uno de los tubos para la lisis de las células. El método estándar de Bradford se utilizó para determinar la proteína liberada por el micelio, utilizando el colorante azul de Coomasie G-250 se puede observar que todas aquellas proteínas existentes en la muestra se tiñen de color azul. Para poder utilizar este método se requiere realizar una curva de calibración o curva estándar, con soluciones de proteínas de concentración conocida, a las cuales se les mide la absorbancia en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 595 nm para luego finalmente poder cuantificarlas. Los residuos de azúcar se determinaron por el método colorimétrico fenol-sulfúrico, que gracias a la reacción que produce azúcares simples, fenol y ácido sulfúrico se obtiene como resultado un color amarillo, naranja. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de carbohidratos presente por lo que se puede cuantificar los azúcares midiendo la absorbancia. Y finalmente la cantidad de VAL-A producida se midió por HPLC; con esta técnica se consigue separar los componentes de una mezcla ya que se basa en los diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias a analizar y la columna cromatográfica.

RNA y análisis de RT-PCR cuantitativa

Los niveles de transcripción de los genes valABC, valKLMN y valG fueron determinados por RT-PCR cuantitativa que corresponde a una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.

Se utiliza para ello los Eppendorf Mastercycler Realplex con One Step PrimeScript-RT-PCR Kit. Las reacciones de control fueron fijadas mediante la adición de RNA sin transcripción inversa en lugar de cDNA. Después de pre-desnaturalizar a 95°C durante 5 min, la amplificación se va a producir en dos pasos: 15 s 95°C para desnaturalizar y 30 s a 60°C para el alineamiento y la elongación y todo este proceso durante 40 ciclos.

Determinación de actividades enzimáticas de ValG

La actividad ValG se analizó de la siguiente manera: La mezcla de reacción (100 µl) con 25 mM Tris–HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 20 mM NH₄Cl, UDP-glucosa de 15 mM, 10 mM validoxylamine A y 2µl de la solución de enzima fue incubada durante 3 h a 30°C, 35°C, 37°C y 42°C, respectivamente, en consonancia con su temperatura de fermentación. Posteriormente, se añadieron 100 µl de cloroformo para detener la reacción y la proteína fue retirada. La actividad enzimática se determinó midiendo la cantidad de VAL-A transformada a partir de validoxylamine por HPLC. La concentración de la proteína de la solución de enzima se determinó por el método estándar de Bradford.

3.       RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como es bien sabido, la síntesis de las proteínas está directamente relacionada con la regulación y expresión de los genes responsables de su producción y la actividad enzimática de las reacciones que la llevan a cabo.

Por ello, el experimento se realizó a tres niveles (cinética de la síntesis proteica, expresión génica y actividad enzimática) relacionados con la producción de validamicina A.

Velocidad de producción

Además de estudiar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de acumulación de la validamicina A, también observaron que la temperatura afectaba a otros factores, como la producción de proteínas intracelulares o el pH.

Proteínas intracelulares

Observaron que en la etapa inicial (hasta 16 horas), la velocidad de acumulación de proteínas intracelulares era mayor a altas temperaturas (37⁰C a 42⁰C). Sin embargo, en la etapa intermedia (hasta 48 horas), la velocidad de síntesis era  mayor a temperaturas inferiores (entre 28⁰C y 35⁰C). Finalmente, en la etapa tardía (hasta 120 horas), la producción a altas temperaturas disminuía considerablemente.

Los resultados que obtuvieron se muestran en la siguiente gráfica:

 Validamicina A

Al igual que en las demás proteínas, en la etapa inicial se observó un aumento de la velocidad de producción a temperaturas altas, sin embargo, este aumento era visible también en la etapa intermedia. En la etapa tardía, la velocidad disminuía a altas temperaturas.

Es destacable la diferencia en las velocidades a las temperaturas de 35⁰C y 37⁰C, lo que conllevó a definir que la temperatura umbral para incrementar considerablemente la producción era la de  37⁰C.

Variación del pH

Una temperatura alta durante la etapa inicial también causa efectos sobre el pH, aumentándolo.

Expresión génica

Para estudiar la expresión de los genes relacionados con la síntesis de Val-A (valABC, valKLMN y valG) se disgregaron las células de Streptomyces hygroscopicus y se purificó su ARN con el método del Trizol y eliminando el ADN con la DNasa I. A partir de este ARN se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa a tiempo real para determinar el grado de expresión de los genes nombrados.

Se observó un aumento en el grado de expresión de estos genes al elevar la temperatura de 35⁰C a 37⁰C en las etapas inicial e intermedia, coincidiendo con el aumento en la producción de validamicina A.

Además la elevada expresión de valABC  y valKLMN  en la etapa inicial a 42⁰C concuerda con una mayor producción del agente antifúngico.

Actividad enzimática

Hay que tener en cuenta que la temperatura tiene un papel importante no sólo a nivel transcripcional, sino también a nivel post-transcripcional. Por ello, se estudió la actividad de dos enzimas: la G6PDH, por su importante función en la ruta de las pentosas fosfato, y la valG, por participar en la última etapa de síntesis de la validamicina A.

En cuanto a la G6PDH, en la ruta de las pentosas fosfato produce un precursor para la biosíntesis del antibiótico, la sedoheptulosa 7-fosfato (S7P). Una elevada temperatura en la etapa inicial aumenta la actividad de la G6PDH y, sin embargo, en la etapa siguiente produce una disminución de la misma. En la etapa tardía apenas se detecta actividad.

Por otro lado, un incremento en la temperatura aumenta la actividad de valG en la etapa inicial, pero hay que tener en cuenta que, en la etapa intermedia el aumento sigue, excepto cuando la temperatura alcanza  los 42⁰C.

4.       CONCLUSIÓN

El incremento de temperatura aumenta la actividad de los genes implicados en la síntesis de Val-A, la actividad de G6PDH (y la ruta PP) y de valG. Todo ello conlleva a una mayor producción de validamicina A.

En conclusión, conociendo la ruta de biosíntesis de la validamicina A (o de cualquier otro compuesto) y los factores que la afectan, se pueden modular para incrementar la producción.

Componentes del grupo: Beatriz García Alonso, Adela Bernabeu Zornoza, Carla Navarro Quiles, Magdalena Nikolaeva Koleva y María Poveda Deltell.

UTILIZACIÓN DE LA TÉCNICA FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL LACTOBACILLUS SPP. EN LECHE FRESCA

¿Cómo identificar y cuantificar la cantidad de microorganismos probióticos en alimentos? 

Palabras clave: Fluorescence in situ hybridization (FISH), sonda PNA (Peptide nucleic acid),Lactobacillus spp. , probióticos . 

Los probióticos son microorganismos vivos añadidos a alimentos, que permanecen activos en el intestino ejerciendo importantes efectos fisiológicos, tales como la digestión y fermentación de sustancias beneficiosas, o la secreción de sustancias que impiden el crecimiento de especies patógenas. Pese a que recientes estudios han cuestionado los posibles beneficios causados por estos microorganismos, éstos son utilizados en gran cantidad de productos lácteos, destacando sobretodo el género Lactobacillus. 

La importancia que se le confiere a estos microorganismos ha sido la causa del estudio realizado por un grupo de investigadores (Almeida et al.) bajo el título: Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification of Lactobacillus spp. in milk samples. El objetivo de este estudio ha sido la creación de una sonda (Lac 663) específica de cepas de Lactobacillus que junto con la técnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) permita la cuantificación directa de Lactobacillus spp. en concentraciones a las cuales estas bacterias probióticas tienen un efecto beneficioso para la salud humana. 

Para la identificación de estas comunidades microbianas, cabe destacar, que anteriormente se utilizaban técnicas de cultivo, mucho más lentas a la hora de obtener los resultados, y costosas. Actualmente se han desarrollado técnicas moleculares que nos aportan información más completa de la comunidad total de bacterias y son más eficaces y rápidas. 

Una de las técnicas más utilizadas y ,precisamente ,la que se emplea en este experimento es la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) que se basa en la hibridación de sondas marcadas, específicas para las regiones de cada taxón de los ribosomas bacterianos, que son detectadas , posteriormente, mediante microscopía de fluorescencia. 

Generalmente para este tipo de técnicas se suele utilizar sondas de ADN pero debido al bajo número de ribosomas en las células, la difícil permeabilización celular y la presencia de estructuras secundarias y terciarias de ARNr, surgen las sondas de ácido nucleico peptídico (PNA) que son las que precisamente utiliza el grupo de investigadores de Almeida. 

El procedimiento experimental seguido por los investigadores con el fin de diseñar, caracterizar y evaluar una nueva sonda de PNA marcada con fluorescencia fue el siguiente:

1.-Diseño de la sonda de PNA, Lac 663

Para el diseño de la sonda, cuyo objetivo es la identificación del género Lactobacillus, se utilizó el programa Primrose y bases de datos de ARNr 16s (Ribosomal Database Project II). Las razones seguidas para su diseño fueron alta complementariedad par las secuencias diana y baja complementariedad para las secuencias no diana. Una vez obtenida la secuencia peptídica se le unió a su N-terminal una molécula de Alexa Fluor 488, para la posterior detección con el microscopio de fluorescencia. 

2.1- Evaluación teórica de la especificidad y sensibilidad de la sonda

Primeramente se realizó una evaluación teórica de la especificidad y sensibilidad de la sonda. Para ello se utilizaron programas informáticos como la base de datos de ARNr 16s mediante los cuales se comprobó la gran especificidad de la sonda Lac663 frente a anteriores sondas diseñadas por otros grupos de investigadores, con fines similares.

La sonda Lac663 tenía, como se observó, mayor especificidad y sensibilidad, 99,66% y 91,52% respectivamente. Además se esperaba de la sonda de PNA un menor número de falsos positivos y, por lo tanto, una mejor aplicabilidad en el análisis de muestras complejas como es la leche fresca, que puede estar contaminada por diversas especies bacterianas. Esto se recoge en la siguiente tabla:

También cabe destacar que la sonda en cuestión era más corta que el resto de las estudiadas, lo que asegura una mejor penetración en la pared celular y una mayor discriminación de desajustes puntuales en las bases nitrogenadas. 

2.2.-Evaluación experimental de la especificidad y sensibilidad de la sonda

En primer lugar se realizó un estudio de la eficiencia de la sonda utilizando 36 cepas del género Lactobacillus, 20 cepas pertenecientes al orden de los Lactobacillales y algunos patógenos en la industria alimentaria. El resultado fue, en términos generales, una hibridación óptima con gran parte de las cepas de Lactobacillus; mientras que en el resto de las cepas se obtuvo una hibridación ausente o pobre, como se observa en la siguiente tabla: 

Las cepas bacterianas utilizadas en ensayos de PNA-FISH en el presente estudio. La eficiencia de la sonda: (-) hibridación ausente; (+) hibridación pobre; (+ +) hibridación moderada (+ + +) hibridación buena, y (+ + + +) hibridación óptima. La tabla muestra el valor promedio de los tres experimentos para cada cepa.

Posteriormente con el microscopio de fluorescencia y la utilización de distintos filtros se comprobó que, efectivamente, la sonda hibridaba solamente con el género Lactobacillus.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de Lactobacillus spp .después del periodo de hibridación con la sonda PNA (Lac 663) asociada a una molécula de Alexa Fluor 488. 

(a)Filtro verde (b) Filtro rojo: L14 L. curvatus L34, L. sakei, E02, S. thermophilus, E04, L. mesenteroides, E06, E. faecium. 

3.-Validación de la sonda PNA en muestras de leche fresca

Tras haber comprobado la especificidad y sensibilidad de la sonda in silico y experimentalmente, ésta se adaptó para detectar y cuantificar muestras de leche fresca. El sistema de detección límite fue establecido, según Ishibashi y Shimamura, en 1x10^7 UFC/ml (unidad formadora de colonias/ml). Se determinó la concentración por dos métodos el muestreo convencional y el PNA FISH. En esta última técnica el recuento fue superior a la CFU, probablemente por la presencia de células no cultivables, como se muestra en la siguiente tabla:

Además, se hizo otro experimento en una leche contaminada con otras cepas que no eran de Lactobacillus. No se observó una hibridación inespecífica con estas cepas.

El estudio se comparó con otras técnicas usadas para la detección de bacterias en muestras industriales, como la epifluorescencia, ARDRA( Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis ) y RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) o qPCR. No obstante éstas técnicas resultaron ser inespecifícas caras y costosas, incapacitaban la numeración de lactobacilos o podría ser inhibida por sustancias presentes en la muestra, respectivamente.

Finalmente se concluyó que la sonda Lac663 era una sonda PNA específica y sensible de Lactobacillus y junto con FISH era una técnica rápida y fiable para la detección y cuantificación de lactobacilos probióticos en matrices complejas. Sólo las muestras de leche con un número eficaz de bacterias muestran resultados correspondientes. 

Referencias bibliográficas: 

International Journal of Food Microbiology 162 (2013) 64–70

Autores del artículo: Antonio Machado , Carina Almeida , Ana Carvalho , Filip Boyen , Freddy Haesebrouck , Ligia Rodrigues ,Nuno Cerca , Nuno Filipe Azevedo.

Autoras del trabajo: Natalia Gómez, Carolina Orjuela, Anna Quirant, Susana Torres, Amaya Vara. 

La producción eficaz de ácido L-láctico a partir de xilosa por una cepa recombinante de Candida utilis

Introducción:

El objetivo de la siguiente investigación pretende conseguir una producción eficiente de ácido L-Láctico a partir de xilosa mediante la utilización de levaduras, en este caso de Candida utilis. Esta cepa es deficiente en piruvato descarboxilasa (necesaria para nuestro fin), por lo que mediante ingeniería genética se obtuvo una cepa recombinante. Ésta era capaz de aumentar la producción de ácido L-Láctico,al conseguir que prefiriese el NADH-xilosa reductasa a la NADPH como la XR nativa.

Experimento: 


Convencionalmente se han utilizado bacterias del ácido láctico para la producción del mismo, pero el interés en especies de levadura como microorganismos alternativos en la producción de ácido láctico ha aumentado, debido a que éstas son más resistentes a un pH bajo. Por ello,  se creó una cepa de levadura recombinante que expresa una lactato deshidrogenasa exógena (LDH) y produce ácido láctico, sin embargo, su productividad es mucho menor que en bacterias.

En otro intento por lograr el objetivo se cogió a Saccharomyces cerevisiae, que al ser una levadura, realiza fermentación alcohólica y no láctica, por lo que el aumento en la producción de alcohol debía de suprimirse. Para ello, los genes que codifica la piruvato descarboxilasa (PDC) se interrumpieron, de forma que se obtuvieron cepas de S. cerevisiae con una mayor producción de ácido láctico, pero esta interrupción causó un defecto en el crecimiento.

Llegados a este punto se buscó un organismo que fuera capaz de utilizar la xilosa eficientemente y degradarla hasta ácido L-Láctico. La ruta a seguir fue observada primero en hongos, por lo que se estudiaron sus mecanismos enzimas,… y se buscaron levaduras con características similares. Hay especies de levaduras que podían ser utilizadas y estaban divididas en tres grupos, el primero, Saccharomyces cerevisiae, no podía metabolizar xilosa natural debido a la falta de enzimas catabólicas adecuadas. El segundo grupo, Candida utilis, podía crecer en xilosa, pero no la fermentaba. Y el tercer grupo, Pichia stipitis y Shehatae candida, podía producir etanol a partir de xilosa.

Las cepas de Saccharomyces cerevisiae modificadas genéticamente producían grandes cantidades de xilitol gracias a su mejora pero en realidad solo servía para producir etanol a partir de xilosa, pero no ácido L-Láctico. La primera información que llegó sobre la producción de ácido L-láctico a partir de xilosa fue de una cepa de P.stipitis genéticamente modificada, que expresa la Lactato deshidrogena (LDH). Por otro lado se encontró una cepa de C. utilis modificada deficiente en PDC y activa para LDH que mostraba una elevada producción de ácido L-Láctico aunque no a partir de xilosa.

Recientemente, se había informado sobre una cepa recombinante de C. utilis que mostraba una preferencia por el NADH, al expresar una proteína XR (xilosa reductasa) de C. shehatae previamente mutada para aumentar su eficiencia (mXR). A esta cepa de C.utilis seguidamente se le introdujo la proteína de C. shehatae XDH (xilitol dehidrogenasa) y a continuación la XK (xilulosaquinasa) de P. stipitis. Aparte se le añadió los plásmidos pVT164 y pVT168 que contienen los genes para dichas proteínas y además el gen de la higromicina B como marcador seleccionable. Dando la cepa mXR/XDH/XK.

En resumen, en la cepa se suprimió el gen que codifica el PDC1 y en su lugar había dos copias del gen Llactato deshidrogenasa (L-LDL) de Bos Taurus, de forma que se trataba de una cepa transformada de Candida utilis y una cepa libre de marcadores perteneciente a Pj0957.
Seguidamente se analizaron los efectos sobre la producción del ácido láctico en términos de especificidad:

                 A continuación, se midieron las actividades enzimáticas, que se refiere a la cantidad de enzima que oxida o reduce un mol de NADP o NADPH por minuto. Las cepas de las que se disponía eran Pj0957, XR/XDH/XK, y mXR/XDH/XK, todas ellas fueron cultivadas en un medio YPD5 (10g/L de extracto de levadura, 20g/L de peptona, y 50g/L de glucosa) o YPX5 (10g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona y 50g/L de xilosa) durante 24 horas a 30oºC y posteriormente se inocularon en un medio de fermentación y se realizaron una serie de pasos que dieron lugar a los siguientes resultados.

Las actividades enzimáticas de las cepas XR/XDH/XK y mXR/XDH/XK que expresan alelos heterólogos de CsheXR, CsheXDH y PsXK eran mucho más altos que los de la cepa control (Pj0957) cultivadas en YPX5.
La actividad XR de la cepa recombinante expresando CsheXR K275R/N277D (MXR / XDH / XK) fue mayor en el presencia de NADH, y menor en la presencia de NADPH en comparación con una cepa que expresa inicialmente CsheXR (XR / XDH / XK). No hubo diferencia significativa entre las cepas de levadura recombinantes de la tasa de de crecimiento de células en YPX5.

Los resultados obtenidos por XR / XDH / XKormXR / XDH / XK indicaban un consumo mucho más elevado de xilosa en comparación con la cepa de control Pj0957. En la cepa XR / XDH / XK se observó una mayor producción L-ácido láctico al igual que una elevada concentración de xilitol frente al control, mientras que la cepa MXR / XDH / XK aunque produjo una elevada cantidad de L-ácido láctico, bajó en su acumulación de xilitol. Durante esta parte del ensayo no se observó una concentración significativa de etanol, glicerol y ácido acético. De estos resultados se dedujo que el NADH producido durante la reducción de xilosa y xilitol aumentaba significativamente la producción de L-ácido láctico a partir de la xilosa.

Seguidamente se observó el efecto de la temperatura sobre la fermentación, obteniéndose que la mayor producción de L-ácido láctico con MXR / XDH / XK a 35ºC. También se buscó incrementar la producción con la utilización de células precultivadas en dos medios diferentes (YPD5 y YPX5) obteniéndose una mayor producción en YPX5 aunque con unos rendimientos no muy diferentes entre sí, por lo que se pensó que podía estar causado por la adaptación a la xilosa.

Los cambios en la expresión de la proteína endógena inducida por el medio de pre-cultivo que contenía xilosa podría aumentar la tasa de producción de ácido L-láctico, porque no se observaron diferencias significativas en la actividad de las enzimas en células MXR / XDH / XK cuando se cultivan tanto en YPD5 y en YPX5 (Tabla 1).

Obteniendo que los transportadores de xilosa de baja afinidad y de alta afinidad se expresan en C. utilis cultivadas en glucosa y xilosa, respectivamente. 

Estos cambios preliminares en la expresión de genes (transportadores de xilosa) inducidos por el medio de cultivo podían acortar el tiempo de fermentación en MXR/XDH/XR.

La respiración de C. utilis no estaba reprimida en medios ricos en glucosa (a diferencia de S. cerevisiae), por lo tanto sus células podían crecer vigorosamente en condiciones aeróbicas.
La cepa de ingeniería de C. utilis con medio de xilosa, poseía genes capaces de fermentarla, se trataba del HXR/XDH/XR, que poseían CsheXR (que prefiere NADH), una CsheXDH y una PsXK. 

Otro dato importante que se obtuvo es el hecho de que no había una acumulación significativa ni de etanol, ni glicerol ni de ácido acético (se muestra en la Tabla 2).
Estas levaduras tenían tolerancia al pH bajo y eran capaces de obtener ácido L-láctico en este pH. 

Conclusión y resultados: 

Después de todo, se obtuvo, con C. utilis, un rendimiento del 70,8% cuando se creció en medio mínimo (6,7g/L de nitrógeno y 100g/L de glucosa) a pH 3,4. Todos estos resultados indicaban que el uso de la cepa de ingeniería de levadura tenía varias ventajas respecto al de las bacterias y se espera llegar al uso adicional de levaduras transgénicas.

Artículo original:

Efficient production of L-lactic acid from xylose by a recombinant Candida utilis strain 
Autores: Hideyuki Tamakawa, Shigehito Ikushima, and Satoshi Yoshida 
Journal of Bioscience and Bioengineering VOL. 113 No. 1, 73–75, 2012 



Trabajo realizado por: Clara Díaz, Ana Navarro, Maribel Ramos, Àngela Soler y Anaïs Tomás

El análisis de la producción de metano por microorganismos autóctonos a un depósito de gas ya mermado para su aplicación en la Recuperación Microbiana Mejorada de Petróleo

Introducción

La recuperación microbiana de petróleo mejorada se basa en la aplicación de métodos para aumentar la capacidad de extraer el crudo (petróleo mantenido en los reservorios) de los yacimientos, mediante el uso de microorganismos.

Los problemas a la hora de recoger el petróleo de los yacimientos suelen estar relacionados con las propiedades que tiene el crudo y los instrumentos utilizados en su extracción: pérdida de gotas por la unión de éstas a las paredes de los tubos de recogida, fluidez poco interesante, etc..

Para evitar estos problemas, se intentan aplicar diferentes métodos que mejoren las características del petróleo y faciliten el trabajo con él.

En el caso de esta investigación caso se examinó la producción de metano por los microorganismos recogidos de un yacimiento agotado. Los resultados indican que los microorganismos autóctonos del reservorio de petróleo podrían utilizar extracto de levadura eficazmente, lo que sugiere que los microorganismos indígenas y nutrientes proteicos podrían ser utilizados para la recuperación de petróleo mejorada por microorganismos.

La recuperación microbiana de petróleo mejorada (Meor)

Generalmente las operaciones de los Meor implican la inyección de nutrientes, junto con cultivos de microorganismos exógenos, en el depósito. Estos nutrientes inyectados promueven la propagación microbiana así como la producción de diversos metabolitos (gases, biopolímeros y biosurfactantes) dentro del reservorio, produciendo biomasa y metabolitos que modifican propiedades del medio en el depósito y del petróleo crudo en sí. Las meor se considera que son más rentables y más ecológicas, puesto que los nutrientes (y microbios) son relativamente menos costosos que los productos químicos y biodegradables. Aunque se ha utilizado en varios yacimientos petrolíferos la tecnología sigue siendo subdesarrollada debido a la falta de fiabilidad del rendimiento.

Algunas de estas dificultades están asociadas a la inyección de microorganismos exógenos en un depósito. Estos microorganismos se enfrentan a dificultades para penetrar en la formación, como la fisicoquímica (ph, presión temperatura y salinidad) propiedades que varían de un deposito a otro.

Además, el coste de los nutrientes inyectados provocan una considerable preocupación ya que recientes demandas de bioetanol han elevado el valor de mercado de los azúcares por lo que las operaciones de tales carbohidratos utilizados en Meor son económicamente menos eficaces.

El objetivo de este estudio

Obtener los conocimientos básicos sobre la actividad de microorganismos que residen en un reservorio de petróleo, para mejorar el rendimiento de Meor, sobre todo teniendo en cuenta los dos anteriores aspectos mencionados.

- Se contempla la posibilidad de utilizar microorganismos autóctonos para marcar depósitos para Meor.

- Con respecto a los nutrientes inyectados también examinaron si las sustancias proteínicas podrían ser utilizadas como un nutriente alternativo para Meor.

Procedimientos (experimentación)

Experimento 1

Se recogieron las comunidades microbianas del depósito del yacimiento petrolífero yabase (akita, Japón) y se examinó la capacidad de producir gases como una actividad microbial representativa. La producción de gases como el metano y el dióxido de carbono es una actividad importante para Meor ya que estos gases pueden mejorar la recuperación de petróleo (represurización del depósito, disminución de la tensión interfacial etc...)

 Muestras microbianas (aguas de formación del embalse) fueron obtenidas de la producción de dos pozos en el yacimiento petrolífero de yabase en agosto de 2008. (Actualmente el depósito está casi agotado de petróleo crudo).

La formación de aguas fueron recogidas de las válvulas de muestreo ubicadas en las cabezas de los pozos en botellas de muestro estériles. Estas botellas se llenaron con mezclas de aceite /agua en un flujo de nitrógeno gas. Minimizando la exposición de las muestras a oxígeno y se enviaron al laboratorio dentro de 24h después de la toma de muestras.

Resultados 1

Los niveles de sulfato y nitrato fueron inferiores a los niveles detectables para los instrumentos utilizados indicando que las condiciones metanogénicas que predominaban en el reservorio.

Experimento 2

Las muestras de agua se dividieron en alícuotas de 75ml en botellas de suero de la adición de NaHCO3 y L-cisteína HCl para el pulido y el agente reductor, respectivamente.

Se añadió a las muestras núms. 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 19, 20, 23 y 24 ( para examinar el efecto de los compuestos derivados del petróleo en la producción de gas microbiano) 750 microlitos de petróleo crudo, una mezcla de, o agua destilada (para el control). Las botellas se sellaron con tapones de caucho gruesos e incubadas anaeróbicamente con N2 o N2-CO2  a 55 ° C sin agitación. Los dos tipos de gases anóxicos se utilizaron para llenar los espacios de cabeza de las botellas para examinar el efecto de la adición de CO2 exógenos sobre la actividad microbial.

Se quería comprobar la compatibilidad entre el proceso de inyección de CO2 EOR y el proceso Meor (es decir, si el CO2 en el Meor y la inyección en los procesos EOR podría ser aplicado en el mismo depósito).

                La producción de CH4 se monitorizó mediante cromatografía de gas, en muestras que en un principio no habían contenido CH4, y que posteriormente, en periodos de 117 a 419 días, todas las muestras mostraron producción activa de este gas.

Resultados 2

A pesar de mostrar pequeñas diferencias en la producción (posiblemente creadas por la diferencia en el número de microorganismo de los diferentes pozos), el O-79 produjo menos con una menor cantidad de microorganismos, en general las muestras con suplemento de extracto de levadura produjeron mayor cantidad de metano y CO2 que las que no contenían el suplemento.

Además no se observó que los gases del espacio superior afectaran a la producción de gas, entendiendo que la adición exógena de CO2 no inhibe a los microorganismos, siendo posiblemente compatible con el modelo de CO2 inyectado del EOR.

Experimento 3

Tras esto se procedió a investigar la diversidad filogenética de las poblaciones microbianas para encontrar las responsables de la mayor producción de gas debido a la suplementación de extracto de levadura. Utilizando las muestras con producción activa tras 419 días de incubación.

Se extrajo el ADN de la población para crear bibliotecas de genes 16S rRNA y parte como plantilla para la PCR. Mediante el paso por el termociclador, la amplificación y posterior purificación y secuenciación de los plásmidos, estos fueron alineados mediante NAST. Posteriormente los arboles filogenéticos se construyeron sobre el modelo de distancia de Tamura-Nei. Se analizaron todas las bibliotecas hasta alcanzar una cobertura de al menos el 95%.

Resultados 3

Los clones representaban tres filotipos únicos pertenecientes a Phylum Euryarchaeota, todos afiliados a los metanógenos e hidrogenotróficos, formadores de metano reduciendo CO2 a CH4 mediante hidrógeno.

Se identificaron Methanoculleus receptaculi, Firmicutes Synergistetes, Thermotogae Coprothermobacteria, Coprothermo bacter proteolyticus y Thermacetogenium phaeum PB.

Particularmente los metanógenos e hidrogenotróficos, Thermacetogenium se relacionan con bacterias oxidantes de acetato, habiendo sido demostrada su mediación cooperativamente en metanogénesis acoplada, lo que sugiere una via contribuyente.

El filo YNB-10 fue comúnmente detectado en todos los suplementados con el extracto de levadura independientemente de los compuestos de petróleo. Los Coprothermobacter no habían sido descritos en estudios previos relacionados con otras bacterias.

Las bacterias Coprothermobacter proteolíticas utilizan los extractos de levadura para producir energía, por lo que la adición de ésta está relacionada con el aumento en la propagación de las bacterias Coprothermobacter, que inicialmente se habían presentado en las aguas en niveles bajos/indetectables.

Las bacterias proteolíticas podrían degradar los sustratos proteínicos en acetato, H2 y CO2 y los productos resultantes serían utilizados por microbios oxidantes de acetato.

Conclusiones

 Ha quedado demostrado pues que el extracto de levadura podría mejorar la producción de gas de microorganismos autóctonos casi agotados, además los resultados sugieren la posibilidad de utilizar otro tipo de sustrato proteico, como aguas residuales, para aumentar la producción.

Las muestras que contenían compuestos de petróleo produjeron más metano que las que no tenían, conteniendo ambas extracto de levadura, quedando claro que los sustratos proteicos mejoran la producción en entornos microbianos donde el crudo está presente.

Por último se observó que la adición de CO2 exógeno no inhibía la producción de gas microbiana, pudiendo ser compatible el método del depósito microbiano MEOR con la inyección de CO2  EOR, y así la unión de estos dos métodos implementar el desarrollo tecnológico y ecológico de EOR.

Palabras clave: Crudo, aguas de formación, MEOR, metano, extracto de levadura, petróleo, microorganismos metanógenos. 

Título original: "Analysis of methane production by microorganisms indigenous to a depleted oil reservoir for application in Microbial Enhanced Oil Recovery". *pincha aquí para acceder al artículo en pubmed*

Autores: Hajime Kobayashi, Hideo Kawaguchi, Keita Endo, Daisuke Mayumi, Susumu Sakata, Masayuki Ikarashi, Yoshihiro Miyagawa, Haruo Maeda, y Kozo Sato.

Publicado en: "Journal of Bioscience and Bioengineering", 2012.

Realizado por los alumnos: Lucía Seguí, Salomé Moreno, Yoel Palazón, Alejandro Sánchez y Raúl Yebana.