Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


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domingo, 31 de mayo de 2015

Producción y caracterización de ectoína por Marinococcus sp. ECT1 aislado de un entorno de alta salinidad.

Seguramente, querido lector, al leer el título de esta entrada se encuentre en la misma situación que antes de hacerlo ¿Qué o quién es Marinococcus sp.ECT1? y ¿qué es la ectoína? Son preguntas que habrán rondado su cabeza. No se preocupe, vamos a responderlas punto por punto y, quizá, incluso consigamos que comprenda el proceso experimental que hay detrás de ellas. Vamos allá.

Salar de Uyuni, medio similar al de Marinococcus ECT1.
Cortesía de TravellersBook.net
   Marinococcus sp. ECT1 es una bacteria, del tipo coco (forma más o menos esférica), descubierta por investigadores taiwaneses en un campo de sal de la isla de Taiwan. Por vivir en esas condiciones tan  salobres esta bacteria, al igual que muchas otras de su entorno, necesita desarrollar un mecanismo de defensa para adaptarse al estrés osmótico en entornos hiperosmóticos, pero ¿qué significa esto realmente? En algún momento de su vida le habrán dicho que no debe beber agua del mar, porque eso le produciría, paradójicamente, una pérdida de líquidos. Dicho de otra forma, hablamos de efectos osmóticos. Ya saben, el paso de disolvente de la cavidad menos concentrada a la más concentrada por una membrana para igualar las concentraciones; y esto es exactamente lo que la mencionada Marinococcus sp. ECT1 necesita evitar. Imagínese, vivir en medio de un desierto de sal no debe ser muy favorable en cuanto a pérdida de agua se refiere. ¿Cómo evitan, por tanto, este fenómeno? Con los llamados solutos compatibles: compuestos que las células, en este caso las bacterias, acumulan en su interior para evitar el paso de fluido a un medio más concentrado. Y aquí es donde entra en juego la ectoína, un compuesto que podrán encontrar en los protectores solares que pronto empezarán a usar. El interés por tanto radica en que una bactería que vive en un medio tan extremo, osmóticamente hablando, como puede ser Marinococcus sp. ECT1 podría llegar a ser una gran productora de ectoína con una buena aplicación en la producción industrial. Y en esto se basa el experimento precisamente: en obtener las condiciones de laboratorio óptimas en las que obtener una producción de ectoína máxima y compararla con otras producciones ya conocidas para valorar su posible uso industrial.

    Partiendo de la cepa ECT1 se procedió a su cultivo añadiendo células a un Erlenmeyer que para producir una fermentación (producción de ectoína) líquida. Dicho Erlenmeyer contenía un medio de cultivo conocido como YCMS, a saber: medio salino con extracto de aminoácidos de levadura. Se escogió este medio tras compararlo con otros disponibles (caldo de lisogenia, principalmente) y certificar un mayor rendimiento en cuanto a crecimiento bacteriano y, por tanto, de producción de producto de interés. Pero no solo del medio inicial de cultivo depende el correcto crecimiento bacteriano. Diversos factores fueron estudiados con el objetivo de determinar las condiciones ideales para la producción de ectoína, entre ellos: temperatura, pH, velocidad de agitación del cultivo, concentración de sal, diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, alimento imprescindible para las bacterias; y la concentración de extracto de levaduras. La mayoría de estos análisis se llevaron a cabo mediante prueba y error. Tras establecer unas condiciones de crecimiento y dejar a las bacterias crecer se determinó la concentración celular, siendo el último paso la purificación de la ectoína producida y el análisis de esta para certificar su pureza y calidad.

Análisis para medir la influencia
de la temperatura en la producción de ectoína.
Yu-Hon Wie et al.
Influencia de la concentración de extracto de levadura
en la producción de ectoína.
Yu-Hon Wie et al.




















    La purificación se llevó a cabo con un primer proceso de centrifugación del cultivo, separando así las células del medio de cultivo. La parte sólida que queda de la centrifugación, se mezcló con etanol, cloroformo y agua en proporción 1:1:1 para, posteriormente, centrifugar esta disolución. Se dejó secar en un horno a 100º C, se volvió a disolver en etanol y se filtró a través de un filtro compuesto por carbón activado. Este carbón activado se separa del etanol hirviéndolo. El extracto final se seca a 100º para eliminar el etanol remanente, obteniendo así ectoína purificada.

  Una vez obtenida la ectoína era necesario realizar un análisis para determinar su estructura química y así poder confirmar que Marinococcus sp. ECT1 es productora de una ectoína que cumple las expectativas deseadas para el producto. Partiendo de una ectoína suministrada por Sigma-Aldrich, se utilizó esta como muestra patrón que marcaría los estándares a alcanzar por la ectoína de Marinococcus sp. ECT1. El análisis se realizó con pruebas como la resonancia magnética nuclear y la espectrometría de masas. Ambas pruebas demostraron que el compuesto sintetizado responde a los estándares de la ectoina, permitiendo conocer también que la ectoina procedente de Marinococcus sp. ECT1 puede contener sales de cloro y demostrando pues, que es una nueva cepa con la que producir ectoína.

Resultado del análisis de resonancia magnética nuclear para ectoína sintetizada por Marinococcus sp. ECT1.
Yu-Hon Wie et al.
   Marinococcus sp ECT1 tuvo un rendimiento en la producción de ectoína igual, o superior, que otros géneros de bacteria utilizados para la producción por lo que sí resultó ser viable para su explotación industrial. Además, el estudio muestra, por primera vez, que Marinococcus sp. ECT1 puede sintetizar ectoina y que la bacteria crece y sintetiza ectoína cuando crece en un medio salino, siendo la tasa de producción la máxima cuando el medio se encuentra en las siguientes condiciones:

Concentración de NaCL: 2M ; 442 mg/L de ectoina como producción máxima.
Fuente de carbono: 40 g/L de extracto de levadura (YE); nivel de producción máxima 2.5 g/L
Tipo de cultivo: cultivo en batch.
Temperatura: 30ºC
pH = 7
Grado de agitación: 200 rpm

   Estas condiciones y resultados son específicas del trabajo de laboratorio y están lejos de tener un una aplicación directa a nivel industrial, por lo que el objetivo actual es desarrollar una estrategia de fermentación para la producción de ectoina que sea práctica para su uso industrial.

BIBLIOGRAFÍA BÁSICA:

Yu-Hong Wei, Fang-Wei Yuan, Wei-Chuan Chen, and Shan-Yu Chen. Production and characterization of ectoine by Marinococcus sp. ECT1 isolated from a high-salinity environment. Journal of Bioscience and BioengineeringVOL. 111 No. 3, 336–342, 2011

ENTRADA REALIZADA POR:

Yeray López Aniorte
Marina Terol González
Jorge Ruiz Ramírez
José Marcos Berna Belmonte
María Elizabeth Salvador Mira 

Producción de pigmentos por Monascus purpureus

¿Nunca os habéis planteado por qué hay camisetas rojas si la lana o el algodón son de color blanco? ¿O por qué la paella es amarilla? Pues bien, esto es gracias a los colorantes y pigmentos. Los pigmentos naturales eran los más utilizados en el siglo XIX en el ámbito textil pero hoy en día la gran mayoría son sintéticos ya que presentan numerosas ventajas. Pero como no todo en esta vida es de color de rosa, presentan además inconvenientes tales como un efecto negativo sobre el medio ambiente. Frente a esto se están buscando una serie de alternativas, como el uso del género Monascus para la producción de pigmentos naturales. 

Os presentamos a la especie Monascus purpureus, que es con la que se ha trabajado. Esta especie es un moho que puede crecer en muchos ambientes fáciles de reproducir. Para este proceso se ha utilizado la fermentación en estado sólido, ya que presenta un menor coste porque los sustratos utilizados proceden de residuos de la industria agroalimentaria. 

Como sustrato se utilizó el raquis de la espiga del maíz, ya que es mucho más barato que otros residuos. La fermentación produjo una concentración más alta de pigmento rojo usando el maíz que usando otros residuos agroindustriales ya que está formado por azúcares fácilmente digeribles por las enzimas de Monascus.

A simple vista esto parece muy fácil, pero ¿cómo se ha llegado a la conclusión de que Monascus es una buena opción para producir pigmentos? La respuesta es bastante obvia, se han estudiado los factores que afectan al crecimiento del hongo y, por tanto, a la producción de pigmento. 

Maíz sin fermentar (izquierda) y fermentado por M. purpureus (derecha)
En los experimentos que se comentan a continuación se midió la biomasa y la producción de pigmentos amarillos (longitud de onda a 412nm) y de pigmentos rojos (longitud de onda a 500nm). 







  • pH: se observó que a pH bajos (1-2) y altos (>8) se inhibe la producción de pigmentos. A partir de pH 2 comienza la producción de pigmento alcanzando a pH 5 la producción máxima de pigmento rojo y a pH 6 de pigmento amarillo. Como se muestra en la gráfica, a partir de pH 6 la producción comienza a disminuir. 




  • Temperatura: M. purpureus es un organismo mesófilo (Tª óptima de crecimiento entre 15-35ºC) y, como es normal, tiene un máximo de producción de pigmento a 30ºC. Como todo en exceso es malo, si aumentamos mucho la temperatura, la producción se reduce drásticamente.




  • Tamaño del inóculo: si tenemos una pequeña cantidad de hongo la biomasa será insuficiente y habrá poco producto, mientras que a grandes cantidades de hongo, se producirá biomasa excesiva y se agotarán los nutrientes. Como se representa en la gráfica, con un tamaño de inóculo de 4 mL se obtiene la máxima producción de pigmento. 



  • Tiempo de incubación. Si se mantiene al hongo durante 168 horas será capaz de producir una máxima cantidad de pigmento. Sin embargo, si se deja incubar mucho más tiempo la cantidad de pigmento empieza a disminuir debido a la fase de muerte. 





  • Humedad. Lo mejor es un punto intermedio, porque si hay mucha humedad disminuye el oxígeno disponible y si hay poca lo que ocurre es que hay menos disponibilidad de nutrientes. Este punto intermedio es el 60% en el cual la producción de pigmento es máxima. 





Una vez que se ha visto cómo afectan los factores externos a Monascus purpureus, para dar el visto bueno a esta alternativa se debe comprobar la estabilidad del pigmento. Entonces se observó que las variaciones del pH afectan al color del pigmento, que es termoestable (no sufre alteración por variaciones de temperatura) y que es no higroscópico (no absorbe la humedad). En conclusión, con este procedimiento se consigue abaratar la producción de pigmentos y aumentar el rendimiento, además de no producir daños en el medio ambiente. 

Todo este trabajo no hubiese merecido la pena si no lo hubiesen realizado pensando en una meta futura, que sería la aplicación en la industria farmacéutica, en cosmética, en la industria textil y en la alimentaria. Cabe destacar la producción del arroz de levadura rojo en países asiáticos y su uso como sustituyente de nitritos en el curado de la carne, disminuyendo los riesgos de padecer cáncer por el consumo excesivo de estos productos. 

Bibliografía

Palanivel Velmurugan, Hyun Hur, Vellingiri Balachandar, Seralathan Kamala-Kannan, Kui-Jae Lee, Sang-Myung Lee, Jong-Chan Chae, Patrick J. Shea, Byung-Taek Oh. "Monascus pigment production by solid-state fermentation with corn cob substrate". Journal of Bioscience and Bioengineering; Sept 2011 doi:10.1016/j.jbiosc.2011.08.009

Autores del blog

Raquel Andreu Ivorra
Rocío Díaz Puertas
Daniel Esteve Moreno
Miriam Gámez García
Oana Solovastru