Actividad antimicrobiana contra Porphyromonas gingivalis y mecanismos de acción de los octadecapéptidos catiónicos Amyl-1-18 y sus análogos con aminoácidos sustituidos.

En la situación actual, la resistencia de los microorganismos a los antibióticos convencionales ha llevado a la búsqueda de nuevas alternativas. En los últimos años  se ha descubierto que los  péptidos antimicrobianos (AMPs), son proteínas de origen natural que tienen propiedades antibióticas, por ello se pretende demostrar en este artículo es que los péptidos antimicrobianos representan una alternativa prometedora a los antibióticos convencionales debido a que pueden evitar la inducción de resistencia bacteriana y que tienen un amplio espectro antimicrobiano y múltiples mecanismos de acción.

En este artículo en concreto, resaltan la importancia de los péptidos alfa-helicoidales, para los cuales proponen varios modelos de interacción con las membranas de las bacterias demostrando la importancia de distintos factores como:

• La carga carga positiva: que es crucial para la unión a las superficies cargadas negativamente de las membranas lipídicas microbianas. También es un factor clave que permite la inserción del péptido de forma selectiva a través de las membranas celulares.
• Las composiciones lipídicas de las membranas celulares en las propiedades antimicrobianas y citotóxicas de las AMP catiónicas alfa helicoidales.
• Selectividad celular de los AMPs: para ello se evaluó la citotoxicidad de los análogos de Amyl-1-18 a la membrana celular de mamífero midiendo la hemólisis de ovinos en diferentes concentraciones de péptidos. 

El estudio del que vamos a hablar se centra en la actividad del péptido antimicrobiano AmyI-1-18 para potenciar la actividad antibacteriana contra Porphyromonas gingivalis (una bacteria asociada con la enfermedad periodontal, patología que afecta a los tejidos que soportan a los dientes).

Éste péptido es un derivado de α-amilasa del arroz (Oryza sativa L. japonica) que en su estructura contiene cuatro aminoácidos con carga positiva (dos argininas y dos lisinas). En el estudio se sintetizaron 12 péptidos derivados del parental Amyl.1-18 en los que se sustituyen estos cuatro aminoácidos por alanina, leucina, y/o arginina y se investigó las actividades antimicrobianas de Amyl-1-18 y sus análogos.

En la siguiente tabla aparecen las secuencias y las propiedades físicas de los péptidos descritos anteriormente.

Para determinar la actividad antimicrobiana realizaron 4 experimentos:

1.     Primero se investiga la contribución de los aminoácidos catiónicos en la actividad antibacteriana de AmyI-1-18 a partir de la síntesis de cuatro análogos sustituidos con alanina. Los resultados ilustran que las propiedades antibacterianas de AmyI-1-18 contra P. gingivalis no fueron mejorados sustituyendo una sola arginina o lisina por alanina y sugieren que la presencia de tres aminoácidos de los cuatro presentes en AmyI-1-18 es importante por sus propiedades antimicrobianas.

                                           AmyI-1-18, círculos negros; AmyI-1-18(K4A), rombos blancos; AmyI-1- 18(R5A), triángulos                                                  blancos; AmyI-1-18(R8A), cuadrados negros; AmyI-1-18(K18A), rombos negros.

2 En el segundo experimento se examina el efecto del aumento de la cationicidad sintetizando tres análogos sustituidos con arginina. Los resultados demuestran que la actividad antibacteriana de AmyI-1-18 contra P. gingivalis se ha mejorado significativamente al sustituir una sola glicina por arginina en la posición 12. Además, indican que esta actividad depende de la posición del residuo de arginina en AmyI-1-18.

                       (B) AmyI-1-18, círculos negros; AmyI-1-18(I11R), cuadrados blancos; AmyI-1-18(G12R), círculos                         blancos; AmyI-1-18(D15R), triángulos blancos.

3.      En el tercer experimento se estudia  el efecto de la mejora de la hidrofobicidad. Para ello, se sintetizan dos análogos sustituidos con leucina cuyos resultados sugieren que la actividad antibacteriana de AmyI-1-18 contra P. gingivalis se ve afectada significativamente sustituyendo el residuo de asparagina en la posición 3 o el residuo de ácido glutámico en la posición 9 con leucina y que la actividad antibacteriana de AmyI-1-18 contra P. gingivalis se mejora mediante el refuerzo de su hidrofobicidad a través de la sustitución con leucina. Además, los resultados obtenidos de los 2 análogos sustituidos de leucina sugieren que el aumento de la hidrofobicidad es más importante que el aumento de la carga positiva de la actividad antibacteriana contra P. gingivalis.

                        (C) AmyI-1-18, círculos negros; AmyI-1-18(N3L), rombos blancos; AmyI-1-18(E9L), triángulos                              blancos.

4.     Por último, se analiza el efecto de una mayor cationicidad y / o hidrofobicidad mediante la sustitución de dos aminoácidos con arginina y / o leucina Estos resultados sugieren que la mejora de la cationicidad y la hidrofobicidad en AmyI-1-18(N3L), la cual exhibe mayor actividad antimicrobiana contra P. gingivalis que los otros análogos, disminuyen la actividad antimicrobiana.

                                      (D) AmyI-1-18, círculos negros; AmyI-1-18(N3L, G12R), cuadrados blancos; AmyI-1-18(N3L,                                                 E9L), triángulos blancos; AmyI-1-18(E9L, G12R), círculos blancos.

Por otra parte, se realizó otro experimento para averiguar la selectividad celular de los péptidos de estudio. La selectividad de los AMPs es muy importante, ya que solo serán útiles si atacan a las células invasoras, sin causar toxicidad en las células hospedadoras. Para ello realizaron el siguiente experimento midiendo la hemólisis causada por Amyl-1-18 y sus análogos. Como control positivo del experimento se utilizó melitina. Y obtuvieron la siguiente gráfica:

Donde aparece representado con círculos negros las muestras tratadas con Amyl-1-18 y en triángulos negros las muestras tratadas con Melitina, mientras que el resto de curvas son las correspondientes a las muestras tratadas con análogos de Amyl-1-18. Como podemos observar, en las muestras tratadas con una pequeña concentración de melitina, hay un gran porcentaje de hemólisis, mientras que en las tratadas con Amyl-1-18 es casi nula.

Para finalizar realizaron otro experimento para averiguar la capacidad que tiene Amyl-1-18 y sus análogos para modificar y romper la membrana plasmática, para ello se lleva a cabo un ensayo de la despolarización de la membrana de células intactas de P. gingivalis. Con el concluyeron que el péptido Amyl-1-18 no tenía capacidad para modificar la membrana y por tanto destruir las células.

Trabajo realizado por:

María Castillo Orenes

Marta García Bagán

Celia García Quintanilla

Encarnación Martínez López

María Ortí Lull

Jennifer Redondo García

Bibliografía:

Antimicrobial activity against Porphyromonas gingivalis and mechanism of action of the cationic octadecapeptide AmyI-1-18 and its amino acid-substituted analogs.