Uso del Genome Shuffling para la producción de ácido poliglutámico.

   

     Uno de los procedimientos más estudiados en microbiología industrial es la obtención de organismos hiperproductores para la obtención de un producto de interés. Un ejemplo podría ser el ácido poli-γ-glutámico o γ-PGA.

El ácido poli-γ-glutámico (γ -PGA) es un polímero microbiano que se sintetiza dentro de la célula a través de diversos enlaces entre los residuos de ácido glutámico. Dicho compuesto es comestible, biocompatible, biodegradable y no es tóxico, por lo que se ha convertido en un prometedor biomaterial con aplicaciones potenciales en la industria, la agricultura, la medicina, la alimentación, los cosméticos y el tratamiento del agua.

El objetivo de este experimento (llevado a cabo por Zeng W et al y publicado en Microbial Biotechnology en el año 2016) es obtener cepas mutantes hiperproductoras de γ -PGA, mediante la técnica del barajeo de genomas, la cual mejora sus características microbianas industriales. Se trata de un método que combina genomas de varios organismos mediante varias rondas de fusión de sus distintos genomas con el fin de obtener un organismo superproductor. Para este estudio, se desarrolló una cepa de B. subtilis GXA-28 en la cual se examinó el rendimiento de γ-PGA y se realizó un análisis metabólico de la biosíntesis de γ-PGA, con el fin de ver si el método del Genome Shuffling es útil para obtener hiperproductores de dicho polímero.

El primer inconveniente del estudio es, por tanto, obtener organismos modificados genéticamente para la superproducción del polímero. ¿Cómo puede llevarse a cabo este proceso? Mediante un proceso basado en 6 etapas que se podrían resumir en realizar mutaciones, fusionar genomas y realizar un cribado de los microorganismos más productores. En primer lugar, es necesario mutagenizar la cepa silvestre (por ejemplo, mediante radiación UV). Posteriormente, preparar los protoplastos (que son organismos que carecen de pared celular) con el fin de que sea más fácil la incorporación de ADN en ellos. Finalmente, se seleccionan las cepas que más rendimiento presenten (tras haber aplicado la mutación) y se fusionan sus genomas (este es el fundamento del Genome Shuffling). Este proceso se realizó diversas veces, seleccionando cada vez individuos de la nueva generación hasta que se llegó a la generación 3 de cepas mutantes, o como lo llamaremos a partir de ahora, F3.

Proceso para la preparación de una genoteca mutante. En ella se muestran los pasos comentados anteriormente. 

 Como lo que interesa realmente es obtener microorganismos hiperproductores de este polímero, lo que se realizó posteriormente fue un estudio en base al rendimiento de cada cepa, siendo este mayor en la F3 (en comparación con las cepas silvestres). Pero, ¿por qué sucede esto?

Rendimiento en la producción de PGA en comparación de la cepa silvestre, mutantes, F1, F2 y F3.

     Para contestar esta pregunta, fue necesario realizar un análisis del metabolismo de nuestro organismo. Para entender mejor todo el proceso, cabe destacar un paso importante en la ruta de formación del ácido poli-γ-glutámico: el paso de isocitrato a alfa-cetoglutarato. A partir de este momento, la ruta metabólica puede divergir de dos maneras diferentes. Por una parte, el alfa-cetoglutarato se puede usar para la formación del succionil coA y por tanto, para continuar el ciclo de Krebs; o bien, se puede emplear para la formación del γ -PGA. Lo que se observó fue que en las cepas mutantes, aumentaba la actividad de la formación del polímero (es decir, la F3 formaba más polímero que la cepa silvestre) mientras que disminuía el flujo hacia la realización del ciclo de Krebs. Con estos resultados, y teniendo en cuenta que la formación de biomasa en la F3 disminuía considerablemente respecto a la cepa silvestre, se puede concluir que estos microorganismos hiperproductores son gratos candidatos a la obtención del ácido poliglutámico en altas concentraciones, pues son capaces de desviar la ruta metabólica del mismo con el fin de obtener una mayor cantidad.

Distintos parámetros de (A) GXA‐28, (B) UV/LiCl‐96, (C) F1‐133, (D) F2‐121, (E) F3‐178. γ‐PGA concentration (g l−1, ●); dry cell weight (g l−1, ▲); glucose concentration (g l−1, □); glutamate concentration (g l−1, ▽). Observamos que la producción del polímero en la F3 es mayor.

Ruta metabólica para la formación del ácido poliglutámico. (A) GXA‐28; (B) UV/LiCl‐96; (C) F1‐133; (D) F2‐121; (E) F3‐178. Los números que aparecen en las flechas (paso de un producto a otro en la ruta metabólica) hacen referencia al rendimiento de la enzima que cataliza ese proceso.

   Además de examinar los niveles metabólicos, también se llevó a cabo un análisis transcripcional. Se examinó el nivel de ARNm del gen pgsB mediante la técnica de RT-PCR, el cual es un gen del complejo γ-PGA sintasa (cataliza la formación de γ-PGA a partir de glutamato). Se comprobó que el nivel de ARNm de dicho gen era mayor en las cepas F3, apoyando así el papel clave que realiza el gen pgsB en la producción de γ-PGA. No obstante, cabe destacar que aún es necesario llevar a cabo más estudios para examinar el nivel de otros genes que están implicados en la producción del polímero. Podríamos decir por tanto, que los organismos pertenecientes a la F3 presentan un mayor rendimiento en la producción de γ-PGA debido a la sobreexpresión del gen pgsB y a la utilización de glutamato extracelular.

En conclusión, podríamos decir que el objetivo fundamental de todo este proceso es aumentar la producción de un polímero mediante el uso de técnicas genéticas. Para ello, es necesario trabajar con organismos mutantes y estudiar tanto su metabolismo como la expresión de su genoma obtenido mediante un proceso de fusión (genome shuffling). Al finalizar nuestro estudio, podemos observar como los organismos mutantes son mayores productores de γ-PGA y por tanto, es una técnica prometedora en la microbiología industrial para aumentar la producción de un producto de interés y consecuentemente, obtener mayor beneficio económico.

Bibliografía: Artículo original

Autores artículo: Wei Zeng, Guiguang Chen, Hao Wu, Jun Wang, Yanliao Liu, Ye Guo

and Zhiqun Liang.
Entrada realizada por: Marta Martínez, Sofía Antón, Blanca Lázaro, Marina González y Paloma Velasco.