Nuevo enfoque espectrofotométrico para la determinación de Validamicina A en la fermentación de Streptomyces hygroscopicus

 

La Validamicina A (Val-A) es un agro-antibiótico antimicótico (o antifúngico), producido por la bacteria Streptomyces hygroscopicus 5008 en la fermentación industrial y muy utilizado, especialmente en Asia, para la protección de plantas contra enfermedades producidas por Rhizoctonia.

Para la determinación de su producción se utiliza el análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Esta técnica permite separar los componentes de una mezcla basándose en las diferentes interacciones químicas entre la sustancia analizada y la columna cromatográfica. Sin embargo, este y los otros métodos que hoy se conocen, presentan inconvenientes cuando se quieren analizar muestras grandes.

Actualmente, se está intentando desarrollar un nuevo método basado en espectrofotometría (medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda) para la determinación de Val-A ya que, cuando esta es sintetizada, es secretado simultáneamente el pigmento melanina. Además, se observa una relación estable entre la concentración de Val-A y el valor de absorción espectral (SA) del pigmento a 450 nm. Por tanto, el método espectrofotométrico permite determinar la producción de Val-A de forma rápida y sencilla. 

Para comprobar su validez, se comparó la productividad de Val-A por el método de HPLC con el método de SA y, con este último,  se observaron resultados positivos que permitían encontrar con éxito cepas con alta productividad de Val-A y tiempo corto de fermentación.

Además, en muchas cepas el antibiótico y el pigmento son regulados por el mismo factor y sus producciones están relacionadas. Por tanto, en la fermentación de Streptomyces hygroscopicus 5008 se podría establecer una ecuación basada en la relación entre el valor de la absorción espectral del pigmento y la concentración de Val-A en el caldo. 

Por tanto, en este trabajo lo que se pretende es establecer un método preciso, rápido y barato utilizando un medio industrial y una cepa de fermentación para cuantificar la producción de ValA y, el método espectrofotométrico anteriormente descrito, podría ser una buena alternativa. Igualmente,  esta investigación también puede ser aprovechada para encontrar antibióticos en aquellas cepas productoras de pigmento.

Para llevar a cabo el experimento se cultivó la cepa S. Hygroscopicus 5008 en placas de agar con harina de soja y maltosa. Se recogieron las esporas desarrolladas y se suspendieron en glicerol durante 7 días a 37ºC. Dicha suspensión de esporas fue cultivada y posteriormente fermentada.

Por otro lado, había que comprobar si el pigmento producido durante la biosíntesis de Val-A era estable. Se examinó su estabilidad térmica, de la luz y la capacidad de resistencia al medio alcalino. A continuación, se comparó el valor de absorción espectral de las muestras de pigmento almacenado en las distintas condiciones. 

El siguiente paso fue la medición de la producción de Val-A. Para ello se tomaba una alícuota del caldo de fermentación cada 24 horas a las que se sometía a posterior centrifugación. Se mezclaba el sobrenadante resultante con cloroformo y, la fase acuosa superior la cual contenía

Val-A y el pigmento, se filtraba desechando la fase orgánica inferior que presentaba proteínas y otros contaminantes. Este sobrenadante filtrado se pasa a un nuevo tubo para las siguientes pruebas. 

A continuación, para llevar a cabo la validación del método espectrofotométrico para la determinación de Val-A, se tomaron tres muestras del tubo anteriormente mencionado cada 24 horas. El valor de SA del pigmento secretado y la producción de Val-A detectados mediante HPCL se ajustaron a una ecuación mediante el software STATA. Se probó que el experimento era repetible y se correspondía con dicha ecuación. 

Por otro lado, para eliminar el efecto de los diferentes componentes del medio que puedan afectar en el color del caldo de fermentación se seleccionaron tres medios: el medio A (descrito anteriormente), el medio B (polvo de arroz, harina de soja, NaCl KH₂PO₄ y CaCO₃) y el medio C (almidón soluble, extracto de levadura, KH₂PO₄ y NaCl). 

También se evaluó la aplicabilidad de la espectrofotometría en la estimación de la producción de Val-A utilizando muestras en condiciones de fermentación diferentes. Lo que se pretendía era observar la relación entre el pigmento y la productividad de Val-A cuando se añadía un estimulante exógeno, el cual se había demostrado que mejoraba la productividad de Val-A. Dado que el pH es un factor importante que influye en el metabolismo microbiano y en el color de pigmento se realizaron varios experimentos variando el pH. 

Por último, se generaron cepas mutantes (mediante irradiación ultravioleta y N-metil-NO-nitroN-nitrosoguanidina) para seleccionar aquellas cepas de Val-A que tuvieran alto rendimiento.  

Se ha estudiado la estabilidad del pigmento en diferentes condiciones anteriormente descritas, por lo que el pigmento se relaciona con la producción de Val-A. Como se muestra en la Fig. 1, el crecimiento de S. hygroscopicus 5008, junto con la producción de  Val-A, condujo a una serie de cambios regulares en el color del caldo de la fermentación. La producción de pigmento y Val-A en condiciones óptimas de cultivo mejoraban ambos su producción, mientras que en condiciones desfavorables, sus metabolismos eran suprimidos. En el análisis transcripcional de los genes de biosíntesis de Val-A y la respuesta del gen relacionado con el pigmento, se demostró que presentaban cooperatividad en diferentes condiciones de fermentación, por tanto, ambos están regulados por los mismos reguladores.  

 

 

Fig 1. Cambio de color del caldo de fermentación en la producción de Val-A. 

Es posible determinar que existe una relación estable con la producción de Val-A y la correlación entre el color del caldo, por lo que la producción de Val-A podría ser la base del método de espectofotometría. Se escogió el valor de 450 nm para medir la absorbancia de la melanina  (pigmento),  que presentaba una relación constante a dicho valor, el cambio se producía debido a la concentración de Val-A de las muestras. Esto llevó a que 450 nm se estableciera como la longitud de onda de detección para establecer la fórmula de ajuste de la producción de Val-A. 

El siguiente paso es la determinación de la fórmula de ajuste en el ensayo de espectofotometría. Para obtener la ecuación tomamos como variables los valores de la concentración de Val-A (Y) determinados por HPLC y el valor de SA a 450 nm (X): 

 El coeficiente de determinación de la ecuación es 0,9928, por lo que muestra un alto grado de ajuste. En la FIG 2., se muestra la curva de ajuste correspondiente a 40 muestras en diferentes cultivos o condiciones de fermentación. 

 

FIG 2. Curva de ajuste de la relación entre la producción de Val-A y el valor de DO (densidad óptica) del pigmento 

Los resultados en unas condiciones de fermentación deben ser verificados por test para una probabilidad dada, normalmente p=0,05. Los ensayos de este trabajo han sido validados por el t-test. El método de HPLC para la determinación de Val-A ha sido ya verificado, por lo que se comparó con el método SA a este.  

 

En la Tabla 1, a diferentes tiempos de fermentación todos los valores de p son superiores a 0,05 (2ª columna), por lo que en el intervalo de confianza del 95% no hay diferencia entre las concentraciones de Val-A detectadas por HPLC y por SA.  

El mayor R.S.D (Desviación Estándar Relativa) en SA es de 0.212 correspondiente a las 48 h, al no ser en este momento el de mayor secreción de Val-A ni de pigmento, esta desviación puede ser aceptada. A las 96 h, es el momento de máxima producción de Val-A. Las R.S.D correspondientes a HPLC y SA a este tiempo son 0.027 y 0.007 respectivamente, lo que confirma que el método SA tiene una buena estabilidad al igual que el método HPLC. 

En los ensayos para la verificación de la viabilidad del método SA se llegó a conclusiones tales como que la productividad de Val-A es mayor a una Tª relativamente más alta junto a una síntesis de proteínas y consumo de azúcar más rápidos. Para verificar la exactitud, repetibilidad y aplicabilidad de la ecuación de ajuste para la determinación cuantitativa rápida de Val-A, se compararon diferentes medios y condiciones de fermentación, tales como la adición de gbutirolactona, etanol, pH, etc. Se comparó una vez más con el método HPLC quedando recogido en la Tabla 2. Además, se analizó la precisión de la espectofotometría a las 120 h, tiempo en el que finaliza la fermentación. Todo mediante la t-test.  

 

Si tanto el valor Pr (T <t) como el de Pr (T> t) [Pr (T> t)=1-Pr (T <t)] son superiores a 0,05, se considera que la hipótesis es aceptada. El resultado demostró que no existía ninguna desviación del paralelismo en este estudio, por lo tanto, el método SA establecido podría considerarse tan exacto como el método HPLC. Aunque los cambios en los cultivos y condiciones de fermentación afectaran a la producción de Val-A y el metabolismo de S. hygroscopicus 5008, se mantenía la relación entre  Val-A y el valor SA, por lo que no afecta a la exactitud y estabilidad de los valores predictivos calculados por la ecuación de ajuste.  

El pretratamiento de muestras no introduce sustancias que puedan afectar a la DO del caldo a 450 nm y el pigmento puede ser estable en un entorno común durante mucho tiempo. Como el método SA se basa en la densidad óptica del pigmento, podría utilizarse para investigar la relación entre la producción de antibióticos y la secreción de pigmentos desde la perspectiva del metabolismo microbiano. Siempre que se pueda obtener una relación cuantitativa y estable, el método SA se podrá utilizar para cuantificar otros antibióticos en la fermentación. 

La cuantificación de Val-A por método de HPLC es precisa, pero el equipo y los reactivos relacionados para HPLC cuestan mucho. El tiempo de análisis para una muestra es de unos 20 minutos, sin incluir la preparación de reactivos, requiriendo todo esto para un gran número de muestras. Todo esto hace que no sea un buen método para la fermentación industrializada, en contra, el método SA no necesita instrumental y reactivos costosos, y además, una gran cantidad de muestras pueden ser analizadas en la placa de 96 pocillos a la vez.  

 

FIG 3. Cribado de mutantes de alto rendimiento por el método SA en placa de 96 pocillos y análisis comparativo de la producción de Val-A mediante método SA y HPLC. Cinco días cultivo wild type 5008 y siete mutantes en dos medios diferentes. (A) La producción de Val-A en el quinto día por el método SA y por HPLC representado en gráfico de barras (B).

El método de ensayo SA descrito en placa de 96 pocillos se utilizó para determinar la productividad de Val-A y el cribado de alto rendimiento  (Fig. 3). Siete mutantes se compararon con los de tipo salvaje 5008 (WT). La productividad de Val-A por el método de SA fue comparada con el método de HPLC. El mutante 4 (M4) fue determinado como la cepa positiva con la mayor productividad (Figura 3B). Además de una selección rápida y conveniente de Cepas, el tiempo de fermentación de los mutantes puede estimarse utilizando SA como un método de monitorización rápido en tiempo real Val-A. También es posible emplear el método SA para cepas con tiempos de fermentación cortos, por lo que es un método con amplias posibilidades de aplicación. Por ahora, no existe un método de prueba rápido de Val-A que pueda satisfacer la demanda industrial ni el ensayo SA en la determinación cuantitativa de antibióticos.  

Referencia bibliográfica:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172316301153?via%3Dihub

Más información acerca de Rhizoctonia:
http://www.cyclamen.com/es/profesional/enfermedades/8/22

Nombres:
Gracia Patricia Mínguez Marco
Carmen Mateu Olivares
Ana Mª Rodríguez Lozoya
Alba Mª Carrascosa Costa
Laura Serrano Arratia
Carmen Molina Pardines