Uso de biosensores para la detección de compuestos BTEX en diferentes ambientes

La contaminación en los diferentes ambientes, como los mares y las ciudades, supone un serio problema para la salud pública y para el medio ambiente. Por ello, uno de los grandes objetivos es la detección específica de compuestos tóxicos, tales como los BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno), procedentes de refinerías y petroleras. Para ello se han desarrollado sistemas informadores de la contaminación que son eficientes, fáciles de usar y baratos: los biosensores.

El biosensor es un instrumento utilizado para la detección de parámetros biológicos o físico-químicos, compuesto por un sensor biológico, como puede ser un cultivo de microorganismos, un transductor que traduce la señal emitida por el sensor y un detector.

En cuanto a los tres biosensores que se han desarrollado y se explican en este artículo van a estar compuestos por un sistema de dos componentes: un regulador de transcripción (TodS-TodT) y el promotor PtodX fusionado a la proteína testigo GFP (Green Fluorescence Protein) que es la proteína informadora. Tal y como se muestra en la imagen.

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El regulador transcripcional activará al promotor en presencia de un compuesto químico determinado, lo cual llevará a la expresión del gen informador que dará una señal que se podrá medir y cuantificar, permitiéndonos así estimar los niveles de contaminación en un ambiente determinado.

Estas construcciones se han introducido en tres cepas aisladas de tres ambientes diferentes: Pseudomonas putida DOT-T1E, Pseudomonas putida KT2440, Alconivorax borkumensis SK2.

Resultados

 Los compuestos BTEX suelen ser tóxicos para los microorganismos, por lo que en primer lugar, se determinó la tasa de tolerancia de las cepas. Para ello se utilizó tolueno como compuesto modelo y se le añadió a las cepas al 0,1% y 0,2%. Se observó que en P.putida DOT-T1E el 100% de las células sobrevivieron; las cepas de P.putida KT2440 sobrevivían con tolueno 0,1% pero con tolueno 0,2% sobrevivían muy pocas células. Lo mismo sucedía con A.borkumensis SK2, por lo que estas dos cepas sólo podían tolerar concentraciones moderadas de tolueno.

En la siguiente gráfica se observa un control (líneas punteadas) sin presencia de tolueno. El resto se han hecho con concentraciones de 0,2% de tolueno(líneas continuas), en cuadrados se representa P.putida DOT-1E, en rombos P.putida KT2440 y en triángulos A.borkumensis SK2.

Otro aspecto importante que se determinó fue el tiempo de exposición óptimo al contaminante. En este caso se utilizó como inductor el tolueno (rango de colores desde blanco a negro), y se vio que a bajas concentraciones de este no había diferencias en la tasa de inducción entre 3,5 y 5 horas, mientras que a altas concentraciones, la tasa de inducción era mayor tras 5 horas, por lo que el tiempo de exposición óptima resultó ser de 5 horas para las tres cepas (se ve mayor fluorescencia).

La gráfica mestra el tiempo de exposición óptimo para A.borkumensis.

También se determinaron los límites de saturación y detección para el tolueno y otros compuestos BTEX, ya que están en correlación directa con la sensibilidad de cada cepa hacia el disolvente orgánico. El límite de detección mínimo es la concentración del inductor en la que la fluorescencia emitida por el biosensor en presencia del inductor es el doble que en ausencia de inductor. El límite de saturación es la concentración de inductor a la que el biosensor alcanza su máxima emisión de fluorescencia. Se observó experimentalmente que los límite de detección y saturación de tolueno en A.borkumensis SK2 eran inferiores que en las dos cepas de P.putida , ya que presentaba menos tolerancia al disolvente orgánico.

Todos estos experimentos para determinar los límites de saturación y detección se realizaron utilizando medios mínimos M9 con glucosa para las dos cepas de P.putida y medios marinos suplementados con piruvato sódico para A.borkumensis SK2. Se realizaron experimentos para comprobar si los biosensores eran apropiados para detectar otros compuestos BTEX, y se observó que detectaban benceno, p-xileno y m-xileno junto con tolueno, pero no se detectó etilbenceno. Además, el límite de saturación del m-xileno fue similar para las tres cepas, por lo que este compuesto no era un buen inductor para el sistema. En el caso del o-xileno (antogonista del tolueno) se observó que cuando se añadía a un cultivo inducido con tolueno, disminuía la fluorescencia. 

De este modo, se pudo afirmar que el biosensor es específico para hidrocarburos aromáticos monocíclicos, detectando específicamente benceno, tolueno y p- y m- xileno. El mejor inductor en benceno, seguido de tolueno y p- xileno. Además, se pudo determinar las características y la eficiencia de cada uno de los tipos de biosensores basadas en las tres cepas comentadas:

a) Biosensor A.borkumensis SK2: dio los mejores resultados en la detección de bajas concentraciones de contaminante. Por tanto, la baja tolerancia frente a algunos de estos compuestos puede limitarlo a la utilización en ambientes altamente contaminados, especialmente en ambientes marinos debido a que la salinidad no afecta a la respuesta del biosensor.

b) Biosensor P.putida DOT-T1E: es la mejor opción debido a que presenta una gran tolerancia y los límites más altos de saturación. Actúa mejor en aguas residuales, aunque también puede en aguas marinas o suelos.

c) Biosensor P.putida KT2440: resultó ser menos eficiente que P.putida DOT-T1E en ambientes marinos. Fue usada para evaluar su rendimiento durante la eliminación del contaminante en el suelo. También se utilizó para el análisis de la volatilización de los compuestos BTEX en suelos artificialmente contaminados.

Visión de futuro

Con todo ello se concluye que estos tres tipos de biosensores, experimentalmente comprobadas sus eficiencias en detección de compuestos BTEX contaminantes, pueden ser completamente efectivos a la hora de advertir sobre vertidos perjudiciales en el medio ambiente, tanto marino como terrestre.

Cabe destacar la relevancia del papel de los biosensores en nuestra actualidad. Su actuación nos alerta con antelación para poder generar una respuesta rápida y efectiva, con el fin de evitar futuros daños ambientales en medios propensos a sufrir el efecto de un vertido contaminante. Además, sus visibles resultados nos hacen preguntarnos sobre la necesidad de un control de contaminaciones y vertidos a nivel industrial. La implantación de biosensores en plantas petrolíferas o industrias químicas y refinerías relacionadas con el procesamiento de compuestos BTEX, supondría una reducción del volumen de residuos generado un aumento de la seguridad y la salud.

Artículo: New family of biosensors for monitoring BTX in aquatic and edaphic enviroments.

Autores: Veronica Hernandez Sanchez, Lazaro Molina, Juan Luis Ramos and Ana Segura* Estación Experimental del Zaid_ın-CSIC, C/ Profesor Albareda s/n, 18008 Granada, Spain.

https://www.researchgate.net/publication/305209335_New_family_of_biosensors_for_monitoring_BTX_in_aquatic_and_edaphic_environments

Trabajo realizado por:
Clara Díaz Requena
Carmen Gómez Muñoz
Marta Hueso García
Rafaela Medel Fernández
Isabel Pérez Ferrer
Carmen María Picazo Córdoba