Análisis comparativo del genoma de los hongos termófilos degradadores de biomasa Myceliophthora thermophila y Thielavia terrestris

     Un gran desafío en la producción de biocombustibles a partir de la degradación de biomasa (celulosa, hemicelulosa y otros polisacáridos) es la búsqueda de enzimas cuya actuación sea rápida y eficiente.

     Actualmente, las celulasas y hemicelulasas mejor estudiadas son producidas por especies mesófilas como Trichoderma, Aspergillus y Penicillium, cuyo crecimiento óptimo se da en un rango de 40 a 50 ºC. Sin embargo, a estas temperaturas las reacciones de sacarificación e hidrólisis requieren tiempos largos, durante los cuales el reactor puede contaminarse.

     Con el objetivo de evitar este problema, una solución sería incrementar la temperatura para aumentar la velocidad de la reacción hidrolítica y, de este modo, disminuir el riesgo de contaminación. Sin embargo, para poder hacer esto son necesarias enzimas termoestables que provengan de hongos termófilos y sean capaces de resistir altas temperaturas. A pesar de que las enzimas de organismos termófilos presentan una actividad celulítica mayor, la cantidad de enzimas extracelulares producidas por estos seres es menor que la de mesófilos.

Distinción entre hongos termófilos y mesófilos

     Por todo lo comentado anteriormente, se realiza a lo largo del artículo un análisis comparativo entre dos especies termófilas, Thielavia terrestris y Myceliophtora thermophila, y una serie se experimentos en los que: a) se intenta caracterizar a los hongos termófilos (saber qué les distingue de los mesófilos) y b) se compara la actividad enzimática de los hongos mesófilos y termófilos al actuar sobre unos sustratos determinados.

     En la primera serie de experimentos que se realizaron, se trató de distinguir termófilos de mesófilos a nivel de ADN, de aminoácidos y de procesos metabólicos. 

     De esta forma, a nivel de ADN se investigó la posible relación entre el contenido del par de bases GC y la termofilia, ya que este par de bases presenta tres puentes de hidrógeno frente a los dos que tiene el par AT. Se observó que el genoma de organismos termófilos presentaba un menor contenido GC que el de mesófilos. Sin embargo, había un mayor contenido GC en regiones codificantes de termófilos que en las regiones codificantes de mesófilos, concretamente en el tercer nucleótido de cada codón. Por otro lado, el contenido de este par de bases no parecía tener ninguna relación con la adaptabilidad térmica en procariotas. 

     En cuanto a nivel de aminoácidos, se trabajó en la búsqueda de posibles firmas que estuviesen relacionadas con la termoestabilidad. Se pudo observar como el motivo “IVYWREL” sí estaba implicado en procariotas termófilos. Sin embargo, estas “firmas” no suponían ninguna diferencia entre hongos filamentosos mesófilos y termófilos.

     Finalmente, se investigó la posible relación entre la capacidad de soportar altas temperaturas y algunos procesos metabólicos como la biosíntesis de membrana, estructura y modificación de la cromatina, el metabolismo de la pared celular del hongo y heat shock proteins (HSP), aunque no se encontró nada que marcara una diferencia entre mesófilos y termófilos.

     En otra línea de experimentos completamente diferente, se pretendió encontrar el origen de la aparición de los hongos termófilos entre los ascomicetos mediante una serie de estudios taxonómicos. Sin embargo, se observó que no existe ninguna relación filogenética, sino que dichos hongos aparecen aislados en todo el Phylum.

Enzimas involucradas en la degradación de biomasa

     Las principales enzimas encargadas en la degradación de biomasa vegetal utilizadas por hongos son las CAZymes, un conjunto de enzimas de diferentes clases y familias que catalizan la ruptura, biosíntesis y modificación de glicoconjugados y polisacáridos.

     Al estudiar como se desenvolvían M. thermophila o T. terrestris en cultivos sobre extractos vegetales, se observaba un incremento en la síntesis de CAZymes, en concreto de GHs y PLs.

     - Glicósidos hidrolasas (GHs): llevan a cabo la hidrólisis de enlaces glicosídicos con un máximo de actividad a pH ácido. T. terrestris produce en mayor cantidad este grupo enzimático; por tanto, su crecimiento óptimo será en medios ácidos.

     - Polisacáridos liasas (PLs): su función es escindir enlaces glicosídicos (1,4). Su máximo de actividad es a pH neutro – básico. M. thermophila produce principalmente esta clase de enzimas, por lo que un medio básico-neutro será el idóneo para su crecimiento.

    Al analizar las proteínas activas en la degradación, se observaba una clara expresión de la familia GH61. Esta familia enzimática se encarga de la degradación de polisacáridos complejos y recalcitrantes, con principal acción sobre la lignocelulosa.

     La lignocelulosa es un polímero de celulosa y hemicelulosa unido fuertemente a lignina, responsable de la rigidez de las paredes celulares vegetales y que supone una de las mayores fuentes de carbono renovables para la producción de biocombustible. La importante cantidad de polisacáridos derivados de la hidrólisis de la lignocelulosa, se utiliza, mediante fermentación, para la producción de bioetanol. El problema es que los robustos enlaces del complejo no favorecen la acción de las hidrolasas de glicósidos utilizadas comúnmente y por ello la familia GH61 compone un conjunto de enzimas de gran interés industrial.

Esquema de producción de biocombustible a partir de lignocelulosa

Perfiles de transcripción en sustratos de biomasa

     También se hizo una comparativa entre lo que ocurre durante el crecimiento de los hongos en glucosa (sistema control) y en dos cereales: la cebada (modelo usado para las monocotiledóneas) y alfalfa (modelo usado para las dicotiledóneas).

  

Expresión de enzimas en diferentes sustratos

    
     En cuanto a las enzimas que modifican la pared (GH16, GH17 y GH72) se pudo observar que se expresaban de igual manera tanto en glucosa como en ambos cereales. Por el contrario, en  referencia a las enzimas que destruyen la pared, se daba expresión tanto en alfalfa como en cebada, pero no en glucosa. 

     Siendo los componentes fundamentales de la cebada, la celulosa y la hemicelulosa, se vio que los genes de los enzimas que se inducían en este cereal estaban relacionados con la composición de dicho sustrato, de manera que se encontraba una alta cantidad de enzimas celulolíticas y xilanolíticas, además de arabinasas y enzimas pectinolíticas, con una disminución progresiva en estas últimas.

     En cuanto a la alfalfa, formada predominantemente por pectina y xilano, se ha descubierto que los genes de los enzimas que se inducen en dicho cereal no están relacionados con la composición de éste. De esta manera, las enzimas xilanolíticas permanecen a un bajo nivel, tanto en T. terrestris como en M. termophila; y en las liasas de pectina, aunque sí hay un incremento en M. termophila, no se denota un aumento en T. terrestris debido a que la degradación de la pectina se hace por medio de una ruta alternativa, con la actividad hidrolítica de la enzima GH28.

     Tras varias investigaciones, se llegó a la conclusión de que los hongos termófilos degradaban la celulosa a un ritmo mayor que los mejores productores de celulasas dentro del grupo de mesófilos (por ejemplo, T. ressei). Teniendo en cuenta que la temperatura óptima de degradación de biomasa de enzimas de termófilos está en un rango de 55 ºC a 70 ºC, se esperaba, por tanto, que a altas temperaturas, los termófilos degradasen más rápidamente.

Actividad hidrolítica sobre alfalfa a diferentes temperaturas

     Se llevaron a cabo varios experimentos sobre alfalfa para confirmar este hecho, utilizando enzimas termófilas (de M. termophila, T. terrestris) y enzimas mesófilas (de C. globossum y T. ressei). En cuanto a las enzimas de las últimas, se obtuvo una temperatura óptima de hidrólisis a 50 ºC en T. ressei y una actividad óptima de degradación en un rango de temperatura entre 30-60 ºC en C. globossum. En referencia a los organismos termófilos, además de obtener una mayor concentración de azúcares, se observaron dos picos de temperatura óptima, uno a 40º y otro a 60º.

     Se planteó como hipótesis a estos resultados la posibilidad de que los termófilos tuvieran diversas enzimas degradadoras de biomasa, algunas de las cuales tuvieran una temperatura óptima de actuación a 40 ºC y otros a 60 ºC. Se contrastó dicha hipótesis clonando 7 xilanasas (termófilas) en Aspergillus niger (mesófilo) y comprobaron que, efectivamente, las temperaturas óptimas de actividad estaban en un rango de entre 45 ºC y 70 ºC.

     En conclusión, se pudo afirmar que los organismos termófilos (M. termophila y T. terrestris) poseían diversas actividades enzimáticas para la degradación de polisacáridos en la pared celular de las plantas y además contaban con un repertorio de enzimas que les permitía hidrolizar biomasa en un amplio rango de temperaturas, posiblemente motivo por el cual estos organismos son ubicuos.

Uso potencial del ciclo sexual para el desarrollo de estirpes

     Otro estudio que se hizo estuvo basado en el potencial del ciclo sexual para crear cepas mejoradas. Para ello se llevaron a cabo cruzamientos sexuales poco comunes entre hongos destinados a la bioproducción (barajeo de genomas, mutagénesis clásica…), sobre todo con M. termophila, destacando aquéllos donde intervenían los genes del apareamiento (mating genes), los cuales tenían un papel esencial en la reproducción sexual de ascomicetos. El problema fue que los resultados obtenidos no fueron satisfactorios.  

     Aun así, actualmente se sigue trabajando en ello, ya que si se consiguieran resultados sería un gran éxito a nivel industrial debido a que podrían cruzar especies naturales y modificadas genéticamente para conseguir aumentar el rendimiento en la degradación de biomasa y así abaratar los costes en la producción de biocombustibles.

     Otra posibilidad que se está explotando también a día de hoy es la expresión de enzimas termófilas en huéspedes mesófilos; así se combinarían las ventajas de alta producción enzimática (mesófilos) con alta actividad hidrolítica (termófilos).

Referencia bibliográfica: Berka et al., Comparative genomic analysis of the thermophilic biomass-degrading fungi Myceliophthora thermophila and Thielavia terrestris

Realizado por: Ángela Cantos García, Ana García Pérez, Oriol Juanola Juárez, Oliver Pérez Howell, Diana Sáez Chica.