Levaduras y producción de nanopartículas.

          La nanotecnología es una ciencia que engloba muchos aspectos de diversas ramas del conocimiento (física, química, biología, etc.). Tiene como objetivo principal el estudio y la síntesis de nanopartículas. Éstas no son más que versiones de los distintos materiales que se utilizan diariamente en muchas industrias e incluso en la vida cotidiana, pero caracterizados por tener tamaños de 1 a 100 nm (1 millón de veces más pequeños que un milímetro). Además poseen propiedades únicas que las diferencian de las que poseen sus análogos a gran escala. Estas propiedades eléctricas, químicas, ópticas, físicas, etc. han hecho que estos materiales sean de vital importancia en diferentes campos como la industria en general, la electrónica, la óptica, e incluso la agricultura, el medio ambiente y la medicina.

En los orígenes de esta ciencia (no hace más de 50 años) se centraban en métodos físico-químicos de síntesis de estos nanomateriales. Actualmente, las investigaciones se centran en la utilidad y aplicaciones de estos compuestos, encontrándose con el inconveniente de que los subproductos del proceso de síntesis clásica dan lugar problemas medioambientales por su toxicidad, limitando mucho sus usos. Sobre todo los clínicos. En este sentido, los investigadores se han visto impulsados a buscar nuevas vías de síntesis más respetuosas con el medio ambiente y que sean económicamente factibles, encontrando en el uso de microorganismos (bacterias, hongos y levaduras) una solución casi perfecta. La síntesis biológica no produce residuos de alta toxicidad y su escalado a nivel industrial podría ser, no solo económicamente factible, sino que muy beneficioso “matando así dos pájaros de un tiro” (1).

A. Distintas nanopartículas B. Uso de nanopartículas como sondas para cancer (2)

Tras años de investigación se pueden encontrar diversos microorganismos que se encargan de la síntesis de nanopartículas inorgánicas como por ejemplo de plata, de oro, de sulfuro de plomo (PbS), etc. Entre todos estos podríamos destacar el sulfuro de cinc (ZnS), cuyas nanopartículas son ampliamente utilizadas en sensores de diversos tipos: glucómetros para diabéticos, pHmetros de laboratorio (que miden la acidez), sensores de radiación UV, etc (3). Esto se debe a que en escalas muy pequeñas, el sulfuro de cinc adquiere propiedades luminiscentes y eléctricas muy particulares que le permiten, usado correctamente, emitir luz o electricidad de manera muy sensible y eficaz en presencia un estímulo. Éste dependerá de para qué y cómo esté diseñado el sensor. Un ejemplo de ello es detectar específicamente la localización de células cancerosas. Cuando  la nanopartícula detecta una célula cancerosa, se une a ella y “emite luz”.

Esta capacidad de emitir luz es la que los hace extraordinariamente atractivos en medicina. Pueden hacerlo gracias a un proceso llamado confinamiento cuántico. Podríamos decir que es un análogo mejorado de la fluorescencia. Ésta consiste en que al darle energía a compuestos especiales, éstos la devuelven inmediatamente después aunque algo disminuida gracias a su estructura química. Un ejemplo de ello sería la quinina presente en el agua de tónica. Si esa forma de energía es la luz, la partícula emitirá luz que a pesar de tener menor energía que la suministrada, seguimos siendo capaces de detectarla.

Las partículas de pequeño tamaño, como las nanopartículas, tienen la peculiaridad de que las pérdidas de la energía suministrada son muy pequeñas y la emisión en forma de luz mucho mayor y muy fácil de detectar. A ésto es a lo que se le llama confinamiento cuántico y por ello se las denomina quantum dots. Además, como podemos ver en la imagen inferior, el color de la emisión depende del tamaño de la nanopartícula. Como veíamos en el ejemplo del ratón, es particularmente interesante esta cualidad, no solo para detectar fácilmente la emisión si no para poder detectar distintos estímulos, por ejemplo, distintos tipos celulares.

A. Mecanismo de emisión de los quantum dot B. Distintas emisiones en función del tamaño

Debido al gran interés que tiene la producción de esta nanopartícula, se ha estudiado su  síntesis en bacterias de diversos tipos. Sin embargo, poco se había estudiado de su producción por levaduras. En este sentido y conociendo la versatilidad de estos microorganismos en procesos industriales, investigadores del Central Leather Research Institute de India, han estudiado si Saccharomyces cerevisiae (la levadura del pan, la cerveza y el vino) es capaz de producir nanopartículas de sulfuro de cinc.

Lo primero que se hizo fue averiguar si la levadura era capaz de sobrevivir a la exposición a la materia prima. Para que se produzca nuestro nanomaterial, hay que suministrarle a las células una fuente de azufre y de cinc (queremos ZnS) y estas fuentes pueden afectar el crecimiento del microorganismo. En este caso, se utilizó sulfato de cinc (ZnSO₄), un suplemento común en alimentación animal y abonos. Se puso en el medio de crecimiento de las células y se observó si había crecimiento y si éste era correcto.

A. Imagen de Microscopio electrónico de Saccharomyces cerevisiae  B. Placa de cultivo de este microorganismo (1) C. Perfil de crecimiento de S. cerevisiae en presencia de materia prima (1)

En la imagen superior se observa a la izquierda una imagen de microscopía electrónica de células de la levadura. En el centro, una placa cultivo en la que ésta crece y a la derecha una representación las medidas realizadas del crecimiento, dónde la línea representa el número aproximado de células en el cultivo. En esta gráfica podemos ver que a medida que pasa el tiempo, el número de células aumenta a pesar de que el medio contenga el sulfato de cinc por lo que las células pueden vivir sin problemas y se puede pasar a investigar la producción de nanopartículas.

Con el fin de optimizar el proceso, los investigadores intentan averiguar las condiciones óptimas de crecimiento. Prueban distintas concentraciones de sustrato y de inóculo (las células que se añadirán al medio para que produzcan las nanopartículas) y tras encontrar las mejores se procede a la síntesis del producto. Tras cultivar a las células en un medio con materia prima, se monitoriza la presencia de las partículas utilizando como señal las propias propiedades ópticas de éstas. Se observa además, que tras un día de cultivo se produce el máximo de producto (como se ve en la imagen inferior a la izquierda) y que éste se encuentra en el interior de las levaduras. A las 24 horas se procede a extraer las partículas utilizando quizás uno de los métodos más sencillos de extracción. Se congelan las células a bajas temperaturas, los cristales de hielo rompen las estructuras celulares provocando que cuando se descongelan bruscamente se libere el contenido. Después, como si de una lavadora se tratara, se centrifuga, obteniendo una disolución con las partículas y descartándose los restos celulares.

Una vez obtenido el producto se procede a caracterizar sus propiedades, es decir, se quiere saber si poseen las características que las hacen tan útiles, ya que al ser producidas por un microorganismo, no se sabe si las conservan todas. Mediante técnicas de microscopía se observa la forma de las nanopartículas (imagen de la derecha). En negro se observan esferitas de distintos tamaños (30-40 nm), todas ellas como dijimos casi un millón de veces más pequeñas que un milímetro. Ésto confirma que al menos tienen el tamaño deseado. Mediante otras técnicas más avanzadas como análisis del espectro de ultravioleta, fotoluminiscencia y difracción de rayos X en polvo, se puede comprobar si la estructura interna de las partículas es la adecuada, así como su capacidad de emitir luz o sus propiedades eléctricas.

A. Perfil de producción de nanopartículas (1) B. Mecanismo de extracción C. Nanopartículas de ZnS al Microscopio electrónico de transmisión (1).

El análisis de los resultados demostró que todas las partículas mostraban las propiedades ópticas, eléctricas y luminiscentes que se buscaban. Ésto confirma por tanto, la hipótesis de los investigadores. La levadura puede sintetizar sin problemas el producto de interés apuntando además como modelo idóneo de síntesis por sus buenas cualidades como "trabajador industrial". Por otro lado, en comparación con otros microorganismos estudiados, las levaduras tienen una mayor capacidad de síntesis de nanopartículas de ZnS, probablemente debido a que su volumen celular es bastante mayor (el doble o triple que algunas bacterias) y que las reacciones que provocan la síntesis de las partículas son más potentes. Sin embargo, poco se sabe acerca de estas reacciones que ocurren en el interior de la célula por lo que se requiere más investigación sobre el tema. Cuando esta información se sepa, podríamos “enseñarle” a las levaduras cómo sintetizar más y mejores nanopartículas de ZnS, y quién sabe, quizás montar una empresa para su producción industrial.

BIBLIOGRAFÍA

1. Facile production of ZnS quantum dot nanoparticles by Saccharomyces cerevisiae MTCC 2918. Sandana Mala J, Rose C. J Biotechnol. 2014 Jan 20;170:73-8. doi: 10.1016/j.jbiotec.2013.11.017. Epub 2013 Dec 6.
2. ZnS nanostructures: From synthesis to applications. Xiaosheng Fang, Tianyou Zhai, Ujjal K. Gautam, Liang Li, Limin Wua, Yoshio Bando, Dmitri Golberg. Progress in Materials Science 56 (2011) 175–287 doi:10.1016/j.pmatsci.2010.10.001
3. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Xiaohu Gao, Yuanyuan Cui, Richard M Levenson, Leland W K Chung, Shuming Nie. Nat Biotechnol. 2004 Aug;22(8):969-76. Epub 2004 Jul 18.

TRABAJO REALIZADO POR: Clara Manzanaro Cifuentes, Sebastián Martínez López, Alba Pérez Martínez,Carla Romero Sansano, Erundina Ruiz Pérez,