Mejora de la producción de MEL por Pseudozyma hubeiensis SY62

Los biosurfactantes (surfactantes producidos por seres vivos) son compuestos que facilitan la mezcla de una sustancia acuosa con una sustancia aceitosa, y son de gran interés en diversas industrias (cosmética, minera, ambiental –en biorremediación-, farmacéutica –como transportadores de fármacos-, etc.). Uno de los biosurfactantes más apreciados son los lípidos de manosileritritol (MEL), que son un tipo de glucolípidos producidos por hongos y bacterias. Se clasifican según su estructura química en MEL-A, MEL-B, MEL-C y MEL-D.

Los MEL son de interés no solo por ser buenos biosurfactantes y tener unas condiciones de producción suaves, sino además por tener otras propiedades que se han demostrado en ciertos estudios (actividad antimicrobiana, unión a la inmunoglobulina G humana, posible terapia contra la leucemia, aumentan la eficacia de ciertas terapias génicas en mamíferos, etc).

Debido a su gran interés como biosurfactante, el investigador japonés Masaaki Konishi y su equipo se propusieron hallar las condiciones óptimas para la producción de MEL mediante cultivo de lote alimentado o fed-batch (que consiste en crecer microorganismos aportándoles los nutrientes que necesitan de forma continua o secuencial). El objetivo es recortar los costes de producción de MEL y obtener la máxima productividad posible. Para ello han empleado como microorganismo productor Pseudozyma hubeiensis SY62, una cepa de levadura aislada del fondo del mar Sagami. Esta levadura produce principalmente MEL-C, aunque también MEL-A y MEL-B.

En primer lugar, se determinó la producción de MEL en condiciones preliminares. Éstas fueron: 200 rpm de velocidad de agitación, 25ºC de temperatura, 50 g/L de aceite de oliva, 50 g/L de glucosa y 2 g/L de extracto de levadura. El resultado fue 7,5 g MEL/L al día, siendo, el objetivo del presente estudio, superar dicho valor de producción.

Así, se realizaron diversos experimentos, en los que se modificaron los siguientes parámetros: velocidad de agitación, temperatura, concentración de extracto de levadura y concentración de las fuentes de carbono (aceite de oliva y glucosa).

Para comprobar que la velocidad de agitación empleada en el experimento inicial era la óptima, estudiaron su efecto en el crecimiento celular y en la producción de MEL. Los resultados mostraron que la velocidad de agitación afecta de forma insignificante al crecimiento celular. Sin embargo, velocidades de agitación menores de 150 rpm o mayores de 200 rpm tienen como resultado una menor producción de MEL. Por tanto, la velocidad de agitación óptima está entre 150 y 250 rpm, lo que confirma que la velocidad de agitación elegida inicialmente, 200 rpm, era correcta. Por eso, para el resto de los experimentos, se siguió utilizando esa velocidad.

También se estudió si la velocidad de agitación afectaba a los distintos tipos de MEL producidos, llegando a la conclusión de que no afectaba. La fracción de MEL-C fue de aproximadamente 70% a todas las velocidades de agitación, la de MEL-A fue del 30% y la de MEL-B fue insignificante.

A continuación, comprobaron si la temperatura empleada inicialmente era la óptima. Para ello, estudiaron el efecto de la temperatura en la producción de MEL y en el crecimiento celular. Así realizaron varios cultivos a diferentes temperaturas, y se vio que el crecimiento celular se estimulaba al ir aumentando la temperatura hasta aproximadamente 34ºC, a partir de la cual caía drásticamente. En cuanto a la producción de MEL, mostraba un máximo a los 25ºC y se inhibía por encima de los 28ºC. Concluyeron por tanto que la temperatura elegida inicialmente, 25ºC, era la óptima. Dicha temperatura es menor que las de otras levaduras productoras de MEL del mismo género, cuyos valores van desde 28ºC a 32ºC.

También se estudió el efecto de la temperatura en los diferentes tipos de MEL producidos. Los resultados de los experimentos muestran que la producción de MEL-B es despreciable y no varía con la temperatura, mientras que el ratio de MEL-C va aumentando desde los 15ºC hasta los 35ºC, y el ratio de MEL-A va disminuyendo en la misma medida. Sabiendo esto, se podrá adecuar la temperatura en los procesos de producción de MEL dependiendo de cuál sea el tipo de MEL que se desea obtener.

Tabla: Producción de MEL a diferentes concentraciones de las fuentes de carbono
y del extracto de levadura.

Seguidamente, se estudió el efecto de la concentración de extracto de levadura (tabla 1). Manteniendo constante la concentración de las fuentes de carbono (aceite de oliva y glucosa), se aprecia que al aumentar el extracto de levadura aumenta la producción de MEL y el crecimiento celular (tabla 1, intentos 1-4, 5-6, 7-8, 9-10). En los intentos del 1 al 4, se observa que al aumentar el extracto de levadura, la producción de MEL aumenta pero no tanto como en el resto de experimentos realizados a concentraciones de fuentes de carbono superiores. Esto se debe a que en los intentos 1-4 la concentración de fuentes de carbono es insuficiente (50 g/L). Por otro lado, en los intentos 7-8 y 9-10, las fuentes de carbono están en exceso, y vemos que, al aumentar el extracto de levadura, la producción de MEL aumenta bastante, pero todos los valores de producción de MEL ya son menores que el máximo obtenido en el intento 6 (49,2 g MEL/L). Por tanto, se puede afirmar que existe una inhibición en la producción de MEL y en el crecimiento celular cuando las fuentes de carbono están en exceso (a partir de 150 g/L), así pues, por más fuentes de carbono que se añadan, no se va a obtener una mayor producción de MEL, sino que ésta incluso disminuirá (tabla 1, 7-10).

También se estudió en estos cultivos el efecto del pH. Los pH finales variaron entre 4’9 y 6’4 (tabla 1, última columna), pero sin seguir un patrón fijo. Por tanto, se dedujo que no había una correlación significante entre el pH final y la producción de MEL y el crecimiento celular. 

Así, de todos estos experimentos, se concluye que las condiciones óptimas de cultivo son: 200 rpm de velocidad de agitación; 25ºC de temperatura; 10 g/L de extracto de levadura; 100 g/L de glucosa y 100 g/L de aceite de oliva (que es lo había en el intento 6 de la tabla 1). 

Finalmente, siguiendo estas condiciones se preparó un cultivo fed-batch de Pseudozyma hubeiensis SY62. Así, se observa que la concentración de MEL. Tres días después de la inoculación de SY62, se comprobó que las fuentes de carbono adicionadas se habían agotado, por lo que se volvió a añadir la misma concentración de glucosa y de aceite de oliva. La concentración de MEL alcanzó los 129 g/L el séptimo día. La productividad volumétrica calculada fue de 18,4 g/L al día (mientras que la del experimento inicial era de 7,5 g MEL/L al día).

                                       

En cuanto al peso seco de las células, en el tercer día alcanzó el valor de 40 g/L y permaneció constante desde entonces. En el séptimo día se comprobó que no había glucosa ni aceite de oliva en el medio, ya que se habían consumido por completo. El coeficiente de rendimiento fue de 0,33 g MEL/g fuentes de carbono. Además, se observó que la proporción de los distintos tipos de MEL se había mantenido constante durante todo el cultivo, siendo la proporción de MEL-C un 62,1%, la de MEL-A un 30,8% y la de MEL-B un 7,1%.                         

La productividad volumétrica de MEL resultante de la cepa SY62 en las condiciones óptimas descritas ha sido la más alta registrada hasta el momento, lo que tendrá un gran impacto, ya que permitirá recortar los gastos de producción de MEL.


Resumen realizado por:
Khouloud Tassnim Abidi, Daniel Cazorla Barrero, Helena Codina Márquez y Sara Fontcuberta Cervera.
Basado en el artículo:
Masaaki Konishi, Takahiko Nagahama, Tokuma Fukuoka, Tomotake Morita, Tomohiro Imura, Dai Kitamoto and Yuji Hatada.
Yeast extract stimulates production of glycolipid biosurfactants mannosylerythritol lipids, by Pseudozyma hubeiensis SY62.
Journal of Bioscience and Bioengineering. Volume 111, Issue 6, June 2011, Pages 702–705 doi:10.1016/j.jbiosc.2011.02.004