Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

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jueves, 26 de mayo de 2016

Efficient expression and purification of porcine circovirus type 2 virus-like particles in Escherichia coli

Efficient expression and purification of porcine circovirus type 2 virus-like particles in Escherichia coli

Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) es un virus de ADN de cadena simple circular perteneciente a la familia Circoviridae. PCV2 se considera el agente responsable de la enfermedad asociada al circovirus porcino (PCVAD), que afecta a cerdos en desarrollo. Los síntomas de la enfermedad son pérdida de peso, diarrea, palidez, debilidad, dificultad respiratoria, entre otros. Esto ha causado un grandes pérdidas en la industria porcina.

PCV2 es un virus pequeño que presenta en su cápside o cubierta viral con un único tipo de proteína, llamada Cap, la  cual, al presentar distintos sitios de unión a un anticuerpo es bastante inmunogénica. Existen proteínas Cap recombinantes que se han expresado en sistemas eucarióticos formando espontáneamente partículas que imitan a la forma nativa del virus, pero sin ácido nucleico viral (VLP). Como candidato para vacunas, VLP es seguro y eficiente ya que es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria humoral y a su vez una respuesta mediada por células inmunitarias propias. Por lo tanto, la proteína Cap es el destino preferido para el desarrollo de nuevas vacunas, las cuales se basan en VLP, para combatir PCV2.

En los últimos años se están intentando expresar la proteína rCap en un sistema procariota como es E.coli, ya que es más fácil y barato de realizar, permitiendo una elevada expresión de la proteína de interés. A pesar de las ventajas anteriormente dichas, encontramos un impedimento: se produce una incorrecta traducción de la proteína perdiendo la capacidad de realizar su función impidiendo así la formación de VLPs. Como veremos, el objetivo de este estudio es mejorar esta expresión en E.coli, es decir, que pueda expresarse correctamente y autoensamblarse para formar VLPs.
https://lh5.googleusercontent.com/T0YXRKgeUO3rvazlmI_IYHwQUAV6VBsgc0_u6e_7XMIsTNKdu6MITg1cgYTeIwXAD8SxDNtwEjIdPZKLnEhrPd8-UaqEREJ_s53Zc80Aj4gcKAZSLByzNH05_w9XZcNiR4BzadfK En primer lugar, se construyó un plásmido recombinante, que fue transformado en E. coli. Para seleccionar las células que habían incorporado el vector, se cultivaron en un medio con kanamicina, ya que este contiene un gen de resistencia a dicho antibiótico (kanR), las que sobrevivan serán las que incorporan el pásmido y por lo tanto las de interés. Además, se analizó la expresión de la proteína rCap en E. coli mediante técnicas de inmunotransferencia como son la electroforesis (SDS-PAGE) y Western blot. Los resultados sugieren que las proteínas rCap sí se expresa en E. coli  y que además podría autoensamblarse de forma correcta para forma VLPs.




Debido a dicha confirmación, las proteínas rCap se autoensamblan formando  VLPs y deben ser purificadas, gracias a la  cromatografía de Exclusión Molecular (CEM), que separa las proteínas en cuanto a tamaño. Tras la purificación, se analizaron mediante una SDS-PAGE y una inmunotransferencia en 14 fracciones. La proteína Cap VLPs se encontró en las fracciones de la 6 a la 9, y las fracciones 6 y 7, son las que presentan mayor pureza.



Estudiaron la morfología de las proteínas rCap purificadas mediante el Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM). Todo ello se realiza con el fin de ver si dicha proteína se autoensambla en VLPs. Según los resultados de TEM, los ácidos nucleicos de E. coli fueron encapsulados por las proteínas rCap y de esta forma los empaquetan formando las VLPS (recordemos que los VLPs no presentan ácido nucleico en su interior por lo que tienen que incorporarlo de algún sitio). Esto se pudo confirmar comparando el tamaño de las VLPs derivadas de E. coli  con las auténticas cápsides de PCV2, siendo mayor el tamaño de las primeras.

El proceso a seguir fue el siguiente: se extrajeron ácidos nucleicos de dichas proteínas rCap encapsuladas, se trataron con cantidades crecientes de DNasa I los ácidos nucleicos y se examinaron mediante una  electroforesis en gel de agarosa. Los resultados indican que la proteína ensamblada en E. coli contiene moléculas de ADN exógeno, debido a las modificaciones realizadas.








https://lh6.googleusercontent.com/zR6zxVT1oyz5fhnO5yTuu13X0jNIQIIIdZXdu2R3AX1XrM3s0Z9Jjv20htEwbx78UBVCylLcRSAUdH0bx89bHRgvjdmQVLUUVd81hyR91-h2SVPcpPdXyueNkJr6mfwXDwz2s75P
Por último se comprobó la respuesta inmunitaria frente a esta proteína rCap. Se realizó ensayos con nueve ratones libres de patógenos específicos (SPF), seis de ellos fueron inmunizados con proteína rCap purificada y tres de ellos recibieron PBS (tampón fosfato salino), siendo los ratones control .

Se evaluó la respuesta inmune humoral por ELISA indirecto. Todos los ratones dieron negativo al introducir la rCap-VLP entre los 0 y 10 días. Pero tras una segunda inmunización, el nivel de anticuerpos producidos aumentó considerablemente en los ratones inmunizados, mientras que los ratones control se mantuvieron igual. Este resultado sugiere que esta proteína suscita una respuesta inmune humoral


A los 39 días, se recogieron los esplenocitos de tres ratones de cada grupo para ser analizada  la respuesta inmune celular mediante el ensayo ELISpot, y se recogió suero para analizar la respuesta humoral mediante el ensayo de neutralización de suero.


https://lh3.googleusercontent.com/8Ns69RrW0a_8u0VuShu_DHECDgzjd-TF6guBVLZfjaprBeYi7z5pLLCqkFx2ZvJzBTY6RLXPBy_H_91PNqDDTOE8ea4ZvRw5g_BGyXEHVX9HAdG0XDr1_Cvg2S49y-kChxWkJ9hK

En la gráfica de la izquierda se observa los resultados del test de neutralización en suero donde los ratones inmunizados sufren un aumento de anticuerpos neutralizantes frente los ratones control ( respuesta inmune humoral ). Mientras que en la gráfica de la derecha se observa la cuantificación de las frecuencias de PCV2 y IFN-γ SC (interferón inmunitario de tipo 2) para evaluar la activación celular inmunitaria de esplenocitos(respuesta celular).
Los resultados se explican por la inducción de una respuesta inmune humoral y celular, que potencia la activación de las células efectoras citotóxicas para eliminar las células infectadas y por la producción de anticuerpos. Por lo tanto, las VLPs de rCap producidas son un antígeno eficiente, que provoca la respuesta de anticuerpos y células T (humoral como celular) frente al virus PCV2 en ratones.

En conclusión, la producción de las VLPs rCap en E. coli podría ser una estrategia alternativa para la producción de una nueva generación de vacunas contra las infecciones de PCV2. Aunque las vacunas ya sean altamente eficaces y se puedan utilizan para controlar la infección por PCV2, es necesario ir más allá para encontrar una vacuna rentable y fiable.

Bibliografía:

Pei-Ching Wu, Tzu-Yu Chen, Jiun-Ni Chi, Maw-Sheng Chien, Chienjin Huang

Journal of Biotechnology. 2016 Feb 20;220:78-85. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.01.017

Grupo:
Verónica Antón Sempere
Esther Galán Solís
Leticia Martínez Ortega
Carmen Núñez García
Alicia Pérez Molina
Alba Valdivieso Martínez.

1 comentario:

  1. Poner un título en inglés no es muy divulgativo que digamos. El estilo de la entrada que habéis escrito es más bien una transcripción de vuestros apuntes. De "divulgativo" tiene poco.

    VLP son las siglas de Virus Like Particle o "Partícula Parecida a un Virus". El significado debería aparecer en el texto (y por cierto, lo hemos dado en clase). El acrónimo VLP es genérico. Hay diversos tipos de VLPs, no hay una sola.

    La primera vez que aparece un nombre biológico debe ir completo (Escherichia coli) luego ya puede usarse el abreviado.

    Poner figuras de geles sin un pie de figura que explique lo que debe verse tampoco es algo muy divulgativo que digamos

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