Nuevo enfoque espectrofotométrico para la determinación de Validamicina A en la fermentación de Streptomyces hygroscopicus

 

La Validamicina A (Val-A) es un agro-antibiótico antimicótico (o antifúngico), producido por la bacteria Streptomyces hygroscopicus 5008 en la fermentación industrial y muy utilizado, especialmente en Asia, para la protección de plantas contra enfermedades producidas por Rhizoctonia.

Para la determinación de su producción se utiliza el análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Esta técnica permite separar los componentes de una mezcla basándose en las diferentes interacciones químicas entre la sustancia analizada y la columna cromatográfica. Sin embargo, este y los otros métodos que hoy se conocen, presentan inconvenientes cuando se quieren analizar muestras grandes.

Actualmente, se está intentando desarrollar un nuevo método basado en espectrofotometría (medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda) para la determinación de Val-A ya que, cuando esta es sintetizada, es secretado simultáneamente el pigmento melanina. Además, se observa una relación estable entre la concentración de Val-A y el valor de absorción espectral (SA) del pigmento a 450 nm. Por tanto, el método espectrofotométrico permite determinar la producción de Val-A de forma rápida y sencilla. 

Para comprobar su validez, se comparó la productividad de Val-A por el método de HPLC con el método de SA y, con este último,  se observaron resultados positivos que permitían encontrar con éxito cepas con alta productividad de Val-A y tiempo corto de fermentación.

Además, en muchas cepas el antibiótico y el pigmento son regulados por el mismo factor y sus producciones están relacionadas. Por tanto, en la fermentación de Streptomyces hygroscopicus 5008 se podría establecer una ecuación basada en la relación entre el valor de la absorción espectral del pigmento y la concentración de Val-A en el caldo. 

Por tanto, en este trabajo lo que se pretende es establecer un método preciso, rápido y barato utilizando un medio industrial y una cepa de fermentación para cuantificar la producción de ValA y, el método espectrofotométrico anteriormente descrito, podría ser una buena alternativa. Igualmente,  esta investigación también puede ser aprovechada para encontrar antibióticos en aquellas cepas productoras de pigmento.

Para llevar a cabo el experimento se cultivó la cepa S. Hygroscopicus 5008 en placas de agar con harina de soja y maltosa. Se recogieron las esporas desarrolladas y se suspendieron en glicerol durante 7 días a 37ºC. Dicha suspensión de esporas fue cultivada y posteriormente fermentada.

Por otro lado, había que comprobar si el pigmento producido durante la biosíntesis de Val-A era estable. Se examinó su estabilidad térmica, de la luz y la capacidad de resistencia al medio alcalino. A continuación, se comparó el valor de absorción espectral de las muestras de pigmento almacenado en las distintas condiciones. 

El siguiente paso fue la medición de la producción de Val-A. Para ello se tomaba una alícuota del caldo de fermentación cada 24 horas a las que se sometía a posterior centrifugación. Se mezclaba el sobrenadante resultante con cloroformo y, la fase acuosa superior la cual contenía

Val-A y el pigmento, se filtraba desechando la fase orgánica inferior que presentaba proteínas y otros contaminantes. Este sobrenadante filtrado se pasa a un nuevo tubo para las siguientes pruebas. 

A continuación, para llevar a cabo la validación del método espectrofotométrico para la determinación de Val-A, se tomaron tres muestras del tubo anteriormente mencionado cada 24 horas. El valor de SA del pigmento secretado y la producción de Val-A detectados mediante HPCL se ajustaron a una ecuación mediante el software STATA. Se probó que el experimento era repetible y se correspondía con dicha ecuación. 

Por otro lado, para eliminar el efecto de los diferentes componentes del medio que puedan afectar en el color del caldo de fermentación se seleccionaron tres medios: el medio A (descrito anteriormente), el medio B (polvo de arroz, harina de soja, NaCl KH₂PO₄ y CaCO₃) y el medio C (almidón soluble, extracto de levadura, KH₂PO₄ y NaCl). 

También se evaluó la aplicabilidad de la espectrofotometría en la estimación de la producción de Val-A utilizando muestras en condiciones de fermentación diferentes. Lo que se pretendía era observar la relación entre el pigmento y la productividad de Val-A cuando se añadía un estimulante exógeno, el cual se había demostrado que mejoraba la productividad de Val-A. Dado que el pH es un factor importante que influye en el metabolismo microbiano y en el color de pigmento se realizaron varios experimentos variando el pH. 

Por último, se generaron cepas mutantes (mediante irradiación ultravioleta y N-metil-NO-nitroN-nitrosoguanidina) para seleccionar aquellas cepas de Val-A que tuvieran alto rendimiento.  

Se ha estudiado la estabilidad del pigmento en diferentes condiciones anteriormente descritas, por lo que el pigmento se relaciona con la producción de Val-A. Como se muestra en la Fig. 1, el crecimiento de S. hygroscopicus 5008, junto con la producción de  Val-A, condujo a una serie de cambios regulares en el color del caldo de la fermentación. La producción de pigmento y Val-A en condiciones óptimas de cultivo mejoraban ambos su producción, mientras que en condiciones desfavorables, sus metabolismos eran suprimidos. En el análisis transcripcional de los genes de biosíntesis de Val-A y la respuesta del gen relacionado con el pigmento, se demostró que presentaban cooperatividad en diferentes condiciones de fermentación, por tanto, ambos están regulados por los mismos reguladores.  

 

 

Fig 1. Cambio de color del caldo de fermentación en la producción de Val-A. 

Es posible determinar que existe una relación estable con la producción de Val-A y la correlación entre el color del caldo, por lo que la producción de Val-A podría ser la base del método de espectofotometría. Se escogió el valor de 450 nm para medir la absorbancia de la melanina  (pigmento),  que presentaba una relación constante a dicho valor, el cambio se producía debido a la concentración de Val-A de las muestras. Esto llevó a que 450 nm se estableciera como la longitud de onda de detección para establecer la fórmula de ajuste de la producción de Val-A. 

El siguiente paso es la determinación de la fórmula de ajuste en el ensayo de espectofotometría. Para obtener la ecuación tomamos como variables los valores de la concentración de Val-A (Y) determinados por HPLC y el valor de SA a 450 nm (X): 

 El coeficiente de determinación de la ecuación es 0,9928, por lo que muestra un alto grado de ajuste. En la FIG 2., se muestra la curva de ajuste correspondiente a 40 muestras en diferentes cultivos o condiciones de fermentación. 

 

FIG 2. Curva de ajuste de la relación entre la producción de Val-A y el valor de DO (densidad óptica) del pigmento 

Los resultados en unas condiciones de fermentación deben ser verificados por test para una probabilidad dada, normalmente p=0,05. Los ensayos de este trabajo han sido validados por el t-test. El método de HPLC para la determinación de Val-A ha sido ya verificado, por lo que se comparó con el método SA a este.  

 

En la Tabla 1, a diferentes tiempos de fermentación todos los valores de p son superiores a 0,05 (2ª columna), por lo que en el intervalo de confianza del 95% no hay diferencia entre las concentraciones de Val-A detectadas por HPLC y por SA.  

El mayor R.S.D (Desviación Estándar Relativa) en SA es de 0.212 correspondiente a las 48 h, al no ser en este momento el de mayor secreción de Val-A ni de pigmento, esta desviación puede ser aceptada. A las 96 h, es el momento de máxima producción de Val-A. Las R.S.D correspondientes a HPLC y SA a este tiempo son 0.027 y 0.007 respectivamente, lo que confirma que el método SA tiene una buena estabilidad al igual que el método HPLC. 

En los ensayos para la verificación de la viabilidad del método SA se llegó a conclusiones tales como que la productividad de Val-A es mayor a una Tª relativamente más alta junto a una síntesis de proteínas y consumo de azúcar más rápidos. Para verificar la exactitud, repetibilidad y aplicabilidad de la ecuación de ajuste para la determinación cuantitativa rápida de Val-A, se compararon diferentes medios y condiciones de fermentación, tales como la adición de gbutirolactona, etanol, pH, etc. Se comparó una vez más con el método HPLC quedando recogido en la Tabla 2. Además, se analizó la precisión de la espectofotometría a las 120 h, tiempo en el que finaliza la fermentación. Todo mediante la t-test.  

 

Si tanto el valor Pr (T <t) como el de Pr (T> t) [Pr (T> t)=1-Pr (T <t)] son superiores a 0,05, se considera que la hipótesis es aceptada. El resultado demostró que no existía ninguna desviación del paralelismo en este estudio, por lo tanto, el método SA establecido podría considerarse tan exacto como el método HPLC. Aunque los cambios en los cultivos y condiciones de fermentación afectaran a la producción de Val-A y el metabolismo de S. hygroscopicus 5008, se mantenía la relación entre  Val-A y el valor SA, por lo que no afecta a la exactitud y estabilidad de los valores predictivos calculados por la ecuación de ajuste.  

El pretratamiento de muestras no introduce sustancias que puedan afectar a la DO del caldo a 450 nm y el pigmento puede ser estable en un entorno común durante mucho tiempo. Como el método SA se basa en la densidad óptica del pigmento, podría utilizarse para investigar la relación entre la producción de antibióticos y la secreción de pigmentos desde la perspectiva del metabolismo microbiano. Siempre que se pueda obtener una relación cuantitativa y estable, el método SA se podrá utilizar para cuantificar otros antibióticos en la fermentación. 

La cuantificación de Val-A por método de HPLC es precisa, pero el equipo y los reactivos relacionados para HPLC cuestan mucho. El tiempo de análisis para una muestra es de unos 20 minutos, sin incluir la preparación de reactivos, requiriendo todo esto para un gran número de muestras. Todo esto hace que no sea un buen método para la fermentación industrializada, en contra, el método SA no necesita instrumental y reactivos costosos, y además, una gran cantidad de muestras pueden ser analizadas en la placa de 96 pocillos a la vez.  

 

FIG 3. Cribado de mutantes de alto rendimiento por el método SA en placa de 96 pocillos y análisis comparativo de la producción de Val-A mediante método SA y HPLC. Cinco días cultivo wild type 5008 y siete mutantes en dos medios diferentes. (A) La producción de Val-A en el quinto día por el método SA y por HPLC representado en gráfico de barras (B).

El método de ensayo SA descrito en placa de 96 pocillos se utilizó para determinar la productividad de Val-A y el cribado de alto rendimiento  (Fig. 3). Siete mutantes se compararon con los de tipo salvaje 5008 (WT). La productividad de Val-A por el método de SA fue comparada con el método de HPLC. El mutante 4 (M4) fue determinado como la cepa positiva con la mayor productividad (Figura 3B). Además de una selección rápida y conveniente de Cepas, el tiempo de fermentación de los mutantes puede estimarse utilizando SA como un método de monitorización rápido en tiempo real Val-A. También es posible emplear el método SA para cepas con tiempos de fermentación cortos, por lo que es un método con amplias posibilidades de aplicación. Por ahora, no existe un método de prueba rápido de Val-A que pueda satisfacer la demanda industrial ni el ensayo SA en la determinación cuantitativa de antibióticos.  

Referencia bibliográfica:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172316301153?via%3Dihub

Más información acerca de Rhizoctonia:
http://www.cyclamen.com/es/profesional/enfermedades/8/22

Nombres:
Gracia Patricia Mínguez Marco
Carmen Mateu Olivares
Ana Mª Rodríguez Lozoya
Alba Mª Carrascosa Costa
Laura Serrano Arratia
Carmen Molina Pardines 

Uso de biosensores para la detección de compuestos BTEX en diferentes ambientes

La contaminación en los diferentes ambientes, como los mares y las ciudades, supone un serio problema para la salud pública y para el medio ambiente. Por ello, uno de los grandes objetivos es la detección específica de compuestos tóxicos, tales como los BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno), procedentes de refinerías y petroleras. Para ello se han desarrollado sistemas informadores de la contaminación que son eficientes, fáciles de usar y baratos: los biosensores.

El biosensor es un instrumento utilizado para la detección de parámetros biológicos o físico-químicos, compuesto por un sensor biológico, como puede ser un cultivo de microorganismos, un transductor que traduce la señal emitida por el sensor y un detector.

En cuanto a los tres biosensores que se han desarrollado y se explican en este artículo van a estar compuestos por un sistema de dos componentes: un regulador de transcripción (TodS-TodT) y el promotor PtodX fusionado a la proteína testigo GFP (Green Fluorescence Protein) que es la proteína informadora. Tal y como se muestra en la imagen.

.

El regulador transcripcional activará al promotor en presencia de un compuesto químico determinado, lo cual llevará a la expresión del gen informador que dará una señal que se podrá medir y cuantificar, permitiéndonos así estimar los niveles de contaminación en un ambiente determinado.

Estas construcciones se han introducido en tres cepas aisladas de tres ambientes diferentes: Pseudomonas putida DOT-T1E, Pseudomonas putida KT2440, Alconivorax borkumensis SK2.

Resultados

 Los compuestos BTEX suelen ser tóxicos para los microorganismos, por lo que en primer lugar, se determinó la tasa de tolerancia de las cepas. Para ello se utilizó tolueno como compuesto modelo y se le añadió a las cepas al 0,1% y 0,2%. Se observó que en P.putida DOT-T1E el 100% de las células sobrevivieron; las cepas de P.putida KT2440 sobrevivían con tolueno 0,1% pero con tolueno 0,2% sobrevivían muy pocas células. Lo mismo sucedía con A.borkumensis SK2, por lo que estas dos cepas sólo podían tolerar concentraciones moderadas de tolueno.

En la siguiente gráfica se observa un control (líneas punteadas) sin presencia de tolueno. El resto se han hecho con concentraciones de 0,2% de tolueno(líneas continuas), en cuadrados se representa P.putida DOT-1E, en rombos P.putida KT2440 y en triángulos A.borkumensis SK2.

Otro aspecto importante que se determinó fue el tiempo de exposición óptimo al contaminante. En este caso se utilizó como inductor el tolueno (rango de colores desde blanco a negro), y se vio que a bajas concentraciones de este no había diferencias en la tasa de inducción entre 3,5 y 5 horas, mientras que a altas concentraciones, la tasa de inducción era mayor tras 5 horas, por lo que el tiempo de exposición óptima resultó ser de 5 horas para las tres cepas (se ve mayor fluorescencia).

La gráfica mestra el tiempo de exposición óptimo para A.borkumensis.

También se determinaron los límites de saturación y detección para el tolueno y otros compuestos BTEX, ya que están en correlación directa con la sensibilidad de cada cepa hacia el disolvente orgánico. El límite de detección mínimo es la concentración del inductor en la que la fluorescencia emitida por el biosensor en presencia del inductor es el doble que en ausencia de inductor. El límite de saturación es la concentración de inductor a la que el biosensor alcanza su máxima emisión de fluorescencia. Se observó experimentalmente que los límite de detección y saturación de tolueno en A.borkumensis SK2 eran inferiores que en las dos cepas de P.putida , ya que presentaba menos tolerancia al disolvente orgánico.

Todos estos experimentos para determinar los límites de saturación y detección se realizaron utilizando medios mínimos M9 con glucosa para las dos cepas de P.putida y medios marinos suplementados con piruvato sódico para A.borkumensis SK2. Se realizaron experimentos para comprobar si los biosensores eran apropiados para detectar otros compuestos BTEX, y se observó que detectaban benceno, p-xileno y m-xileno junto con tolueno, pero no se detectó etilbenceno. Además, el límite de saturación del m-xileno fue similar para las tres cepas, por lo que este compuesto no era un buen inductor para el sistema. En el caso del o-xileno (antogonista del tolueno) se observó que cuando se añadía a un cultivo inducido con tolueno, disminuía la fluorescencia. 

De este modo, se pudo afirmar que el biosensor es específico para hidrocarburos aromáticos monocíclicos, detectando específicamente benceno, tolueno y p- y m- xileno. El mejor inductor en benceno, seguido de tolueno y p- xileno. Además, se pudo determinar las características y la eficiencia de cada uno de los tipos de biosensores basadas en las tres cepas comentadas:

a) Biosensor A.borkumensis SK2: dio los mejores resultados en la detección de bajas concentraciones de contaminante. Por tanto, la baja tolerancia frente a algunos de estos compuestos puede limitarlo a la utilización en ambientes altamente contaminados, especialmente en ambientes marinos debido a que la salinidad no afecta a la respuesta del biosensor.

b) Biosensor P.putida DOT-T1E: es la mejor opción debido a que presenta una gran tolerancia y los límites más altos de saturación. Actúa mejor en aguas residuales, aunque también puede en aguas marinas o suelos.

c) Biosensor P.putida KT2440: resultó ser menos eficiente que P.putida DOT-T1E en ambientes marinos. Fue usada para evaluar su rendimiento durante la eliminación del contaminante en el suelo. También se utilizó para el análisis de la volatilización de los compuestos BTEX en suelos artificialmente contaminados.

Visión de futuro

Con todo ello se concluye que estos tres tipos de biosensores, experimentalmente comprobadas sus eficiencias en detección de compuestos BTEX contaminantes, pueden ser completamente efectivos a la hora de advertir sobre vertidos perjudiciales en el medio ambiente, tanto marino como terrestre.

Cabe destacar la relevancia del papel de los biosensores en nuestra actualidad. Su actuación nos alerta con antelación para poder generar una respuesta rápida y efectiva, con el fin de evitar futuros daños ambientales en medios propensos a sufrir el efecto de un vertido contaminante. Además, sus visibles resultados nos hacen preguntarnos sobre la necesidad de un control de contaminaciones y vertidos a nivel industrial. La implantación de biosensores en plantas petrolíferas o industrias químicas y refinerías relacionadas con el procesamiento de compuestos BTEX, supondría una reducción del volumen de residuos generado un aumento de la seguridad y la salud.

Artículo: New family of biosensors for monitoring BTX in aquatic and edaphic enviroments.

Autores: Veronica Hernandez Sanchez, Lazaro Molina, Juan Luis Ramos and Ana Segura* Estación Experimental del Zaid_ın-CSIC, C/ Profesor Albareda s/n, 18008 Granada, Spain.

https://www.researchgate.net/publication/305209335_New_family_of_biosensors_for_monitoring_BTX_in_aquatic_and_edaphic_environments

Trabajo realizado por:
Clara Díaz Requena
Carmen Gómez Muñoz
Marta Hueso García
Rafaela Medel Fernández
Isabel Pérez Ferrer
Carmen María Picazo Córdoba

Stimulating soil microorganisms for mineralizing the herbicide isoproturon by means of microbial electroremediating cells

La principal actividad para la eliminación de contaminantes en el medio ambiente es la biodegradación, donde se utiliza el metabolismo de microorganismos para degradar dichos componentes (se puede comprobar haciendo click aquí). Estos procesos dependen de diferentes factores como: los propios microorganismos o el número de aceptores de electrones terminales (TEA), es decir, sustancias que reciben los electrones procedentes de las reacciones químicas. La falta de estos aceptores hace que los contaminantes desaparezcan más lentamente en ciertas condiciones.

La hipótesis y lo que se ha propuesto en este artículo ha sido la utilización de una serie de electrodos (sólidos conductores aceptores de electrones, MERCs) para mejorar la biodegradación de los contaminantes respecto a la forma clásica, la cual consiste solamente en desplazar los residuos.

El objetivo del trabajo fue probar que al utilizar electrodos en potenciales positivos se favorece la degradación de sustancias nocivas acumuladas en el suelo.

Figura 1: modelo de las células en las que
se ha llevado a cabo el experimento

Para ello se han llevado a cabo una serie de experimentos en los que se midió la degradación de un compuesto contaminante en el suelo. El residuo de interés empleado fue un herbicida llamado isoproturon (IPU), marcado con carbono radiactivo (que nos permite observar su degradación). Para poder realizar el estudio se prepararon una serie de muestras de suelo que no contenían ninguna traza de este herbicida. A continuación estas muestras fueron contaminadas de forma controlada con unas cantidades determinadas de IPU. Finalmente, las muestras se sometieron a una serie de condiciones (distintos potenciales en los electrodos y medio inundado sin oxígeno) tras las que se registró la degradación del contaminante. El experimento se realizó en un sistema como el que se muestra en la Figura 1.  

En la siguiente gráfica (Figura 2) se representan los resultados de los primeros 25 días del experimento. Tal y como representa la línea de puntos triangulares, la degradación del agente contaminante en presencia de electrodos con potencial positivo es  unas 20 veces superior respecto a la dada en condiciones normales, representada por la línea de puntos cuadrados.  

Figura 2: degradación del agente contaminante
en función del tiempo y de la presencia de electrodos
con un potencial positivo (pol-MERC) o sin estos
electrodos (control)

Sin embargo, tras 25 días, el sistema perdió funcionalidad debido a la saturación de los electrodos (se generan especies negativas que se adhieren a los electrodos positivos). Por esta razón, se realizó un experimento a más largo plazo en el que se llevó a cabo la inversión del potencial (600 mV a -300 mV) de los electrodos, con el objetivo de liberar las especies que impedían el correcto funcionamiento del sistema. Los resultados de este experimento a largo plazo se indican en la Figura 3.

Figura 3: tasa de mineralización frente al tiempo.
En el día 25 se observa un pico que hace referencia
a la inversión del potencial de electrodos

Tras el análisis de los resultados identificamos un descenso en el crecimiento de la mineralización acumulativa, así como un decaimiento de la tasa de mineralización: de estos resultados concluimos que el potencial ha de ser positivo para que se produzca la degradación de la sustancia nociva.

A su vez, es necesario destacar las perspectivas de futuro de esta técnica. Como ya se ha comentado, la degradación de los contaminantes puede ser llevada a cabo por microorganismos de la zona si se encuentran en condiciones adecuadas. En cambio, si estas condiciones no son favorables, se estudia el uso de técnicas como la electrorremediación que mejora considerablemente el metabolismo de los microorganismos que se encargan de eliminar los contaminantes del medio (biorremediación). En un futuro, pueden ser eficaces para procesos de descontaminación de suelos agrícolas. Sin embargo, su uso no se limita a suelos agrícolas, sino que también se está convirtiendo en una técnica ampliamente usada para la limpieza del medio ambiente, con aplicaciones paliativas muy eficaces frente a catástrofes ecológicas. Es importante el desarrollo de estas técnicas tanto para el medio ambiente como para la agricultura, ya que una inversión en técnicas de este tipo supondría un ahorro a largo plazo puesto que la tierra empleada para un cultivo anterior en el que se ha echado fertilizante, por ejemplo, se puede reutilizar con mayor eficacia, minimizando la contaminación causada por pesticidas y aumentando la productividad de las cosechas.

Referencias bibliográficas

• Rodrigo Quejigo et. al (2016) Stimulating soil microorganisms for mineralizing the herbicide isoproturon by means of microbial electroremediating cells. Microb Biotechnol, 9(3): 369–380  [PubMed]
• http://www.miliarium.com/Prontuario/TratamientoSuelos/Bioventing.asp
• http://www.argenbio.org/index.php?action=novedades&note=202
• http://www.cienciaydesarrollo.mx/?p=articulo&id=71

Uso del Genome Shuffling para la producción de ácido poliglutámico.

   

     Uno de los procedimientos más estudiados en microbiología industrial es la obtención de organismos hiperproductores para la obtención de un producto de interés. Un ejemplo podría ser el ácido poli-γ-glutámico o γ-PGA.

El ácido poli-γ-glutámico (γ -PGA) es un polímero microbiano que se sintetiza dentro de la célula a través de diversos enlaces entre los residuos de ácido glutámico. Dicho compuesto es comestible, biocompatible, biodegradable y no es tóxico, por lo que se ha convertido en un prometedor biomaterial con aplicaciones potenciales en la industria, la agricultura, la medicina, la alimentación, los cosméticos y el tratamiento del agua.

El objetivo de este experimento (llevado a cabo por Zeng W et al y publicado en Microbial Biotechnology en el año 2016) es obtener cepas mutantes hiperproductoras de γ -PGA, mediante la técnica del barajeo de genomas, la cual mejora sus características microbianas industriales. Se trata de un método que combina genomas de varios organismos mediante varias rondas de fusión de sus distintos genomas con el fin de obtener un organismo superproductor. Para este estudio, se desarrolló una cepa de B. subtilis GXA-28 en la cual se examinó el rendimiento de γ-PGA y se realizó un análisis metabólico de la biosíntesis de γ-PGA, con el fin de ver si el método del Genome Shuffling es útil para obtener hiperproductores de dicho polímero.

El primer inconveniente del estudio es, por tanto, obtener organismos modificados genéticamente para la superproducción del polímero. ¿Cómo puede llevarse a cabo este proceso? Mediante un proceso basado en 6 etapas que se podrían resumir en realizar mutaciones, fusionar genomas y realizar un cribado de los microorganismos más productores. En primer lugar, es necesario mutagenizar la cepa silvestre (por ejemplo, mediante radiación UV). Posteriormente, preparar los protoplastos (que son organismos que carecen de pared celular) con el fin de que sea más fácil la incorporación de ADN en ellos. Finalmente, se seleccionan las cepas que más rendimiento presenten (tras haber aplicado la mutación) y se fusionan sus genomas (este es el fundamento del Genome Shuffling). Este proceso se realizó diversas veces, seleccionando cada vez individuos de la nueva generación hasta que se llegó a la generación 3 de cepas mutantes, o como lo llamaremos a partir de ahora, F3.

Proceso para la preparación de una genoteca mutante. En ella se muestran los pasos comentados anteriormente. 

 Como lo que interesa realmente es obtener microorganismos hiperproductores de este polímero, lo que se realizó posteriormente fue un estudio en base al rendimiento de cada cepa, siendo este mayor en la F3 (en comparación con las cepas silvestres). Pero, ¿por qué sucede esto?

Rendimiento en la producción de PGA en comparación de la cepa silvestre, mutantes, F1, F2 y F3.

     Para contestar esta pregunta, fue necesario realizar un análisis del metabolismo de nuestro organismo. Para entender mejor todo el proceso, cabe destacar un paso importante en la ruta de formación del ácido poli-γ-glutámico: el paso de isocitrato a alfa-cetoglutarato. A partir de este momento, la ruta metabólica puede divergir de dos maneras diferentes. Por una parte, el alfa-cetoglutarato se puede usar para la formación del succionil coA y por tanto, para continuar el ciclo de Krebs; o bien, se puede emplear para la formación del γ -PGA. Lo que se observó fue que en las cepas mutantes, aumentaba la actividad de la formación del polímero (es decir, la F3 formaba más polímero que la cepa silvestre) mientras que disminuía el flujo hacia la realización del ciclo de Krebs. Con estos resultados, y teniendo en cuenta que la formación de biomasa en la F3 disminuía considerablemente respecto a la cepa silvestre, se puede concluir que estos microorganismos hiperproductores son gratos candidatos a la obtención del ácido poliglutámico en altas concentraciones, pues son capaces de desviar la ruta metabólica del mismo con el fin de obtener una mayor cantidad.

Distintos parámetros de (A) GXA‐28, (B) UV/LiCl‐96, (C) F1‐133, (D) F2‐121, (E) F3‐178. γ‐PGA concentration (g l−1, ●); dry cell weight (g l−1, ▲); glucose concentration (g l−1, □); glutamate concentration (g l−1, ▽). Observamos que la producción del polímero en la F3 es mayor.

Ruta metabólica para la formación del ácido poliglutámico. (A) GXA‐28; (B) UV/LiCl‐96; (C) F1‐133; (D) F2‐121; (E) F3‐178. Los números que aparecen en las flechas (paso de un producto a otro en la ruta metabólica) hacen referencia al rendimiento de la enzima que cataliza ese proceso.

   Además de examinar los niveles metabólicos, también se llevó a cabo un análisis transcripcional. Se examinó el nivel de ARNm del gen pgsB mediante la técnica de RT-PCR, el cual es un gen del complejo γ-PGA sintasa (cataliza la formación de γ-PGA a partir de glutamato). Se comprobó que el nivel de ARNm de dicho gen era mayor en las cepas F3, apoyando así el papel clave que realiza el gen pgsB en la producción de γ-PGA. No obstante, cabe destacar que aún es necesario llevar a cabo más estudios para examinar el nivel de otros genes que están implicados en la producción del polímero. Podríamos decir por tanto, que los organismos pertenecientes a la F3 presentan un mayor rendimiento en la producción de γ-PGA debido a la sobreexpresión del gen pgsB y a la utilización de glutamato extracelular.

En conclusión, podríamos decir que el objetivo fundamental de todo este proceso es aumentar la producción de un polímero mediante el uso de técnicas genéticas. Para ello, es necesario trabajar con organismos mutantes y estudiar tanto su metabolismo como la expresión de su genoma obtenido mediante un proceso de fusión (genome shuffling). Al finalizar nuestro estudio, podemos observar como los organismos mutantes son mayores productores de γ-PGA y por tanto, es una técnica prometedora en la microbiología industrial para aumentar la producción de un producto de interés y consecuentemente, obtener mayor beneficio económico.

Bibliografía: Artículo original

Autores artículo: Wei Zeng, Guiguang Chen, Hao Wu, Jun Wang, Yanliao Liu, Ye Guo

and Zhiqun Liang.
Entrada realizada por: Marta Martínez, Sofía Antón, Blanca Lázaro, Marina González y Paloma Velasco. 

Actividad antimicrobiana contra Porphyromonas gingivalis y mecanismos de acción de los octadecapéptidos catiónicos Amyl-1-18 y sus análogos con aminoácidos sustituidos.

En la situación actual, la resistencia de los microorganismos a los antibióticos convencionales ha llevado a la búsqueda de nuevas alternativas. En los últimos años  se ha descubierto que los  péptidos antimicrobianos (AMPs), son proteínas de origen natural que tienen propiedades antibióticas, por ello se pretende demostrar en este artículo es que los péptidos antimicrobianos representan una alternativa prometedora a los antibióticos convencionales debido a que pueden evitar la inducción de resistencia bacteriana y que tienen un amplio espectro antimicrobiano y múltiples mecanismos de acción.

En este artículo en concreto, resaltan la importancia de los péptidos alfa-helicoidales, para los cuales proponen varios modelos de interacción con las membranas de las bacterias demostrando la importancia de distintos factores como:

• La carga carga positiva: que es crucial para la unión a las superficies cargadas negativamente de las membranas lipídicas microbianas. También es un factor clave que permite la inserción del péptido de forma selectiva a través de las membranas celulares.
• Las composiciones lipídicas de las membranas celulares en las propiedades antimicrobianas y citotóxicas de las AMP catiónicas alfa helicoidales.
• Selectividad celular de los AMPs: para ello se evaluó la citotoxicidad de los análogos de Amyl-1-18 a la membrana celular de mamífero midiendo la hemólisis de ovinos en diferentes concentraciones de péptidos. 

El estudio del que vamos a hablar se centra en la actividad del péptido antimicrobiano AmyI-1-18 para potenciar la actividad antibacteriana contra Porphyromonas gingivalis (una bacteria asociada con la enfermedad periodontal, patología que afecta a los tejidos que soportan a los dientes).

Éste péptido es un derivado de α-amilasa del arroz (Oryza sativa L. japonica) que en su estructura contiene cuatro aminoácidos con carga positiva (dos argininas y dos lisinas). En el estudio se sintetizaron 12 péptidos derivados del parental Amyl.1-18 en los que se sustituyen estos cuatro aminoácidos por alanina, leucina, y/o arginina y se investigó las actividades antimicrobianas de Amyl-1-18 y sus análogos.

En la siguiente tabla aparecen las secuencias y las propiedades físicas de los péptidos descritos anteriormente.

Para determinar la actividad antimicrobiana realizaron 4 experimentos:

1.     Primero se investiga la contribución de los aminoácidos catiónicos en la actividad antibacteriana de AmyI-1-18 a partir de la síntesis de cuatro análogos sustituidos con alanina. Los resultados ilustran que las propiedades antibacterianas de AmyI-1-18 contra P. gingivalis no fueron mejorados sustituyendo una sola arginina o lisina por alanina y sugieren que la presencia de tres aminoácidos de los cuatro presentes en AmyI-1-18 es importante por sus propiedades antimicrobianas.

                                           AmyI-1-18, círculos negros; AmyI-1-18(K4A), rombos blancos; AmyI-1- 18(R5A), triángulos                                                  blancos; AmyI-1-18(R8A), cuadrados negros; AmyI-1-18(K18A), rombos negros.

2 En el segundo experimento se examina el efecto del aumento de la cationicidad sintetizando tres análogos sustituidos con arginina. Los resultados demuestran que la actividad antibacteriana de AmyI-1-18 contra P. gingivalis se ha mejorado significativamente al sustituir una sola glicina por arginina en la posición 12. Además, indican que esta actividad depende de la posición del residuo de arginina en AmyI-1-18.

                       (B) AmyI-1-18, círculos negros; AmyI-1-18(I11R), cuadrados blancos; AmyI-1-18(G12R), círculos                         blancos; AmyI-1-18(D15R), triángulos blancos.

3.      En el tercer experimento se estudia  el efecto de la mejora de la hidrofobicidad. Para ello, se sintetizan dos análogos sustituidos con leucina cuyos resultados sugieren que la actividad antibacteriana de AmyI-1-18 contra P. gingivalis se ve afectada significativamente sustituyendo el residuo de asparagina en la posición 3 o el residuo de ácido glutámico en la posición 9 con leucina y que la actividad antibacteriana de AmyI-1-18 contra P. gingivalis se mejora mediante el refuerzo de su hidrofobicidad a través de la sustitución con leucina. Además, los resultados obtenidos de los 2 análogos sustituidos de leucina sugieren que el aumento de la hidrofobicidad es más importante que el aumento de la carga positiva de la actividad antibacteriana contra P. gingivalis.

                        (C) AmyI-1-18, círculos negros; AmyI-1-18(N3L), rombos blancos; AmyI-1-18(E9L), triángulos                              blancos.

4.     Por último, se analiza el efecto de una mayor cationicidad y / o hidrofobicidad mediante la sustitución de dos aminoácidos con arginina y / o leucina Estos resultados sugieren que la mejora de la cationicidad y la hidrofobicidad en AmyI-1-18(N3L), la cual exhibe mayor actividad antimicrobiana contra P. gingivalis que los otros análogos, disminuyen la actividad antimicrobiana.

                                      (D) AmyI-1-18, círculos negros; AmyI-1-18(N3L, G12R), cuadrados blancos; AmyI-1-18(N3L,                                                 E9L), triángulos blancos; AmyI-1-18(E9L, G12R), círculos blancos.

Por otra parte, se realizó otro experimento para averiguar la selectividad celular de los péptidos de estudio. La selectividad de los AMPs es muy importante, ya que solo serán útiles si atacan a las células invasoras, sin causar toxicidad en las células hospedadoras. Para ello realizaron el siguiente experimento midiendo la hemólisis causada por Amyl-1-18 y sus análogos. Como control positivo del experimento se utilizó melitina. Y obtuvieron la siguiente gráfica:

Donde aparece representado con círculos negros las muestras tratadas con Amyl-1-18 y en triángulos negros las muestras tratadas con Melitina, mientras que el resto de curvas son las correspondientes a las muestras tratadas con análogos de Amyl-1-18. Como podemos observar, en las muestras tratadas con una pequeña concentración de melitina, hay un gran porcentaje de hemólisis, mientras que en las tratadas con Amyl-1-18 es casi nula.

Para finalizar realizaron otro experimento para averiguar la capacidad que tiene Amyl-1-18 y sus análogos para modificar y romper la membrana plasmática, para ello se lleva a cabo un ensayo de la despolarización de la membrana de células intactas de P. gingivalis. Con el concluyeron que el péptido Amyl-1-18 no tenía capacidad para modificar la membrana y por tanto destruir las células.

Trabajo realizado por:

María Castillo Orenes

Marta García Bagán

Celia García Quintanilla

Encarnación Martínez López

María Ortí Lull

Jennifer Redondo García

Bibliografía:

Antimicrobial activity against Porphyromonas gingivalis and mechanism of action of the cationic octadecapeptide AmyI-1-18 and its amino acid-substituted analogs.

Deja que Leuconostoc mesenteorides cuide de ti

CAPACIDAD TECNOLÓGICA Y APLICACIONES DE CEPAS BIOACTIVAS AISLADAS DE LECHE CRUDA DE CAMELLO ARGELINO

Los probióticos han sido siempre el gancho comercial más recurrido en cuanto a la venta de lácteos y productos digestivos, mayormente yogures, bajo el pseudónimo de reguladores de la flora intestinal y con el lema de “sentirte mejor por dentro”; pero ¿qué son realmente? ¿Cuál es su modo de actuación?

Los alimentos probióticos son alimentos con microorganismos vivos adicionados que permanecen activos en el intestino, en cantidad suficiente como para alterar la microbiota intestinal del huésped. Ingeridos en cantidades suficientes, pueden tener efectos beneficiosos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) definió los probióticos como «Microorganismos vivos que, cuando son suministrados en cantidades adecuadas, promueven beneficios en la salud del organismo hospedador». 

El tema de estudio del artículo consiste en la posibilidad de la actuación de la leche de camello como probiótico debido al descubrimiento en ella de cepas bacterianas con propiedades probióticas.

Figura 1.  Leuconostoc mesenteroides como potencial probiótico

Estas cepas bacterianas son bacterias ácido lácticas (LAB). Éstas han sido importantes en el ámbito de la alimentación durante siglos debido a sus diferentes contribuciones a los productos alimenticios. Gracias a varios metabolitos que producen (ácidos orgánicos, sustancias conservantes, polisacáridos, vitaminas, endulzantes...) estas bacterias contribuyen al sabor, olor, textura, valor nutricional, etc. de los alimentos. 

Mediante el estudio de muestras de leche de camello se determinó que ciertas cepas presentes en la leche (B7 y Z8 de Leuconostoc mesenteroides subespecie mesenteroides) tenían una alta capacidad de inhibir el crecimiento de Listeria spp, un género de bacterias en las que ciertas especies son patógenas, y Staphylococcus aureus que también puede producir una gran gama de enfermedades.  

Figura 2. Representación del logaritmo del número de células (log N) versus el tiempo de cultivo. Se observa una disminución del crecimiento de las bacterias patógenas en cultivos mixtos debido a las bacteriocinas de L. mesenteroides

Así mismo se observó que la cepa B7 de L. mesenteroides producía una bacteriocina (proteína producida por bacterias que inhibe el crecimiento o mata otras bacterias) que fue identificada como leucocina B; una bacteriocina que inhibe el crecimiento de un amplio espectro de bacterias.

Por otra parte se determinó que las dos cepas de Leuconostoc mesenteroides exhibían un marcado perfil probiótico mostrando una alta supervivencia a pH bajo (2-3 y 4) en presencia de 0.5%, 1%, y 2% de sales biliares y de 3 mg/mL de pepsina (estas dos últimas siendo sustancias presentes en el tracto digestivo que con frecuencia impiden la supervivencia de ciertos microorganismos no adaptados). 

Figura 3. Estudio del número de células (indicado en UFC/mL) de las cepas B7 y Z8 de L. mesenteroides a pH 2, 3 y 4. Z8 muere al cabo de 3 horas a pH 2, mientras que el resto de cepas permanecen estables en el tiempo a los distintos pH.

Por tanto, debido a la capacidad de las cepas de L. mesenteroides encontradas en la leche de camello de inhibir el crecimiento de especies que pueden provocar enfermedades y su alta capacidad de sobrevivir en condiciones como las antes detalladas y que se dan en el sistema digestivo humano se considera que la leche de camello tiene un alto potencial como probiótico, a falta de investigaciones más profundas.

Artículo:
Technological Aptitude and Applications of Leuconostoc mesenteroides Bioactive Strains Isolated from Algerian Raw Camel Milk.
Zineb Benmechernene, Hanane Fatma Chentouf, Bellil Yahia, Ghazi Fatima, Marcos Quintela-Baluja, Pilar Calo-Mata, and Jorge Barros-Velázquez

https://www.hindawi.com/journals/bmri/2013/418132/

Realizado por:
Raquel Pastor Martín
Sonia Coves Mora
María Hernández Marín
Jésica Martínez Godfrey