PACE (evolución continua y dirigida de biomoléculas)

Uno de los principales problemas a la hora de evolucionar biomoléculas en el laboratorio con el  fin de que adquieran propiedades nuevas son las numerosas rondas de mutaciones que se requieren para ello, lo cual conlleva mucho tiempo y trabajo por parte del experimentador. Un método para disminuir tanto el tiempo  requerido como la intervención humana es la PACE.

En la PACE (Phage Assisted Continuous Evolution; evolución continua asistida por fagos)  se utiliza un quimiostato (laguna) en el que previamente hay bacteriófagos modificados para que sean menos infectivos; así mismo en el quimiostato hay un flujo continuo de entrada y salida de bacterias. El bacteriófago contiene el gen que codifica la proteína de interés a evolucionar. El virus infecta a la bacteria y esta expresa el gen del virus, que codifica la proteína de interés; dicha proteína induce la expresión de un gen contenido en la bacteria necesario para la infectividad del virus.

En este método se utilizan tres plásmidos:

-El plásmido del virus (SP), que contiene el gen de la proteína a evolucionar, el gen de la polimerasa T7 y al que se ha eliminado el gen III, que codifica la proteína III (pIII) necesaria para la infectividad del virus.

-El plásmido accesorio (AP)  que contiene el gen III  y el promotor  de T7. Para la expresión de la proteína III se necesita la unión de la polimerasa de T7 a su promotor.

-El plásmido mutagénico  (MP) que aumenta la tasa de mutación inhibiendo los sistemas de corrección de errores en la replicación del material genético.

La bacteria inicialmente contiene el plásmido mutagénico y el plásmido accesorio; cuando el virus infecta a la bacteria le introduce el plásmido (SP) que contiene el gen de la polimerasa T7 (gen que codifica la proteína de interés). La bacteria expresa la polimerasa de T7 que se une al promotor de T7 permitiendo la expresión de la proteína III consiguiéndose  de esta forma que el virus pueda infectar a nuevas bacterias. Por tanto para la expresión del gen III se necesita que la polimerasa de T7 se una a su promotor específico (promotor de T7).

Se fuerza a evolucionar a la polimerasa de T7 a base de modificar progresivamente el promotor contenido en el plásmido accesorio de la bacteria: en un principio el plásmido accesorio contiene el promotor de T7, seguidamente se introducen en la laguna bacterias que contienen el plásmido accesorio con un promotor híbrido T7/T3 y finalmente bacterias cuyo plásmido accesorio contiene el promotor de T3. Así, de esta forma los virus que hayan sufrido una  mutación en el gen que codifica para la polimerasa de T7 podrán unirse a un promotor que no es específicamente el promotor T7, es decir, podrán unirse al promotor de T3 y expresar la pIII, por tanto, serán más infectivos y permanecerán en la laguna, mientras que los virus cuyo gen que codifica a la polimerasa de T7 no haya sufrido mutación no podrán unirse al promotor de T3, por tanto no podrán expresar la pIII, no podrán infectar a nuevas bacterias y serán lavados de la laguna.

La “evolución” de la polimerasa se basa por tanto en las mutaciones causadas indirectamente por el plásmido mutagénico, las cuales permitirán a la polimerasa T7 la unión a un promotor que no sea el de la polimerasa T7.

En conclusión, con este sistema se consigue la evolución de la polimerasa de manera rápida, sencilla, eficaz y con la mínima intervención del investigador, cosa que se puede ver con los resultados del experimento:

De la misma forma este proceso podemos aplicarlo a la evolución de otras biomoléculas siempre que podamos asociar la expresión de las mismas al gen III.