Los mutantes deficiente-respiratorios de Zymomonas mobilis muestran un mayor crecimiento y producción de etanol bajo condiciones aeróbicas y de alta temperatura

Zymomonas mobilis. Imagen insertada por el profesor. Fuente: EJBiotech

Autores

Takeshi Hayashi, Yoshifumi Furuta y Kensuke Furukawa

Introducción

Zymomonas mobilis es una bacteria Gram-negativa anaerobia facultativa que puede fermentar determinados azúcares a través de una ruta metabólica productora de bioetanol, en ocasiones, con mayor eficacia que las levaduras. Posee un ciclo de Krebs incompleto, carente de genes para 2 enzimas, pero posee unas características muy fuertes para realizar las vías de síntesis de pirúvico a partir de glucosa o gliceraldehído-3-fosfato. Este organismo también muestra una alta tasa de captación de azúcares, fermentando a etanol estos tipos específicos. Además, el rendimiento de síntesis de etanol como combustible es del 97%, muy superior al 90-93% de Saccharomyces cerevisiae.

Los genes de Z. mobilis implicados en su respiración aún son un misterio. Recientemente, se descubrió que el gen ndh (ZMO1113) es el único encargado en las rutas del NADH y NADPH. Su ruta metabólica es muy importante, ya que nos puede proporcionar claves para mejorar la producción de etanol.

Las cepas mutantes con deficiencias respiratorias, o RDM, son mucho más evidentes en las levaduras ya que poseen una mayor tasa de fermentación y un mayor rendimiento en la producción de etanol. Estas cepas mutantes aparecen de forma espontánea o mediante la exposición de agentes químicos como acriflavina. Sin embargo, en Z. mobilis aún no se ha descubierto la forma de inducir este tipo de mutación, aunque sí se han obtenido de forma artificial.

La fermentación a temperaturas altas reduce los costes de refrigeración y evita la contaminación por microorganismos mesófilos. Así, las cepas termo-tolerantes de Z. mobilis podrían ser beneficiosas para la fermentación de etanol a altas temperaturas. Una de tales cepas, TISTR 405, muestra una actividad de alto crecimiento y fermentación de etanol a 39 °C.

Materiales y métodos

Cepas y medios de cultivo

La especie Z. mobilis ZM6 (ATCC 29191) se utilizó al igual que la cepa silvestre y de ella se obtuvieron varias cepas RDM. El crecimiento celular y la producción de etanol se examinaron utilizando un medio que contiene 0,5% de extracto de levadura y 2% de glucosa; para medio sólido, 1,5% de agar. Antibióticos, tales como sulfato de estreptomicina (Sm), sulfato de gentamicina (Gm) y la rifampicina (RIF) y monosulfato de kanamicina (Km).

Aislamiento de cepas de RDM

Los mutantes resistentes a los antibióticos fueron aislados de la cepa de Z. mobilis silvestre ZM6. La cepa silvestre en fase estacionaria se inoculó en el medio líquido y 100 l se extendieron sobre los medios sólidos que contenian diversos antibióticos. Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de la cepa silvestre en medios líquidos y en medios sólidos fueron los siguientes: Rif, 10 mg / ml y 5 mg / ml; Sm, 300 mg / ml y 150 mg / ml; Gm, 15 g / ml y 10 mg / ml; Km, 30 mg / ml y 5 mg / ml, respectivamente. Las cepas resistentes aisladas fueron repetidamente y rutinariamente cultivadas en medios líquidos y sólidos con concentraciones aumentadas de los respectivos antibióticos para obtener mutantes con mayor resistencia. Además, dobles mutantes resistentes a los antibióticos tales como Sm / Km, Sm / Rif, Sm / Gm, Rif / Km, y Rif / Gm también fueron aislados en medios líquidos y sólidos. Las cepas mutantes se cultivaron durante toda una noche en el medio líquido sin antibióticos, y entonces 100 l de cada cultivo se extendió sobre tres tipos de medios sólidos que contienen etanol y glucosa [4% (v / v) ethanol/16% (w / v) glucosa, 5% / 16%, y% 5/14%, respectivamente]. Los medios sólidos se sellaron y se incubaron a temperatura ambiente hasta que aparecieron las colonias.

Cultivo aeróbico y anaeróbica de cepas RDM

Se realizaron cultivos anaeróbicos (3 ml) sin agitación en tubos de ensayo a 30 ° C y 39 ° C (temperatura alta). Los cultivos aeróbicos se llevaron a cabo de la misma manera, pero estos se agitaron a 220 rpm. Los resultados obtenidos aquí se expresan como las medias de al menos tres experimentos. Se hicieron baños aeróbicos con los cultivos con un volumen de 2 litros trabajando en un fermentador de jarra de 5 litros con 300 rpm de agitación a 30 ° C, el oxígeno disuelto (DO) se controló continuamente. Cultivos de una noche se inocularon para su uso en todos los experimentos de crecimiento. El crecimiento celular se monitorizó mediante densidad óptica a 660 nm.

Los métodos de análisis

pO2 (saturación de oxígeno disuelto tanto por ciento) se midió mediante un electrodo de oxígeno de tipo galvánico. Se centrifugaron cultivos de una noche (100 ml) y se lavaron en tampón fosfato 10 mM (pH 6,9). A continuación, las células se resuspendieron en 1 L de la misma solución tampón y luego se transfirieron al fermentador de jarra de 5-L . El consumo de oxígeno de las células se midió utilizando un electrodo de oxígeno después de la adición de 2% de glucosa a 30 ° C. La concentración celular se determinó como DO 660, y la masa celular seca se calculó por referencia a una curva de calibración.

La concentración de etanol se determinó por cromatografía de gas. La columna era una columna en espiral (2 m por 3 mm de diámetro interno) rellena con un Q Porapak, y se utiliza a 155 °C. La concentración de etanol se calculó por referencia a una curva de calibración.

Preparación de ARN total

Los ARN totales para los experimentos de microarrays de ADN se extrajeron de los cultivos agitados de cepas silvestres y cepas RDM-4 cultivadas a 30 ° C, un cultivo anaeróbico de la cepa silvestre crecida a 30 ° C, y un cultivo anaeróbico de RDM-4 crecido a 38 ° C. Debido al bajo rendimiento de ARN total extraído a 39 ° C, la condición de alta temperatura se adoptó como 38 ° C. Las células se cultivaron hasta la fase logarítmica tardía y se trató inmediatamente con el reactivo de RNAprotect bacteriana para la estabilización de ARN. El ARN total se extrajo con un kit RNeasy Midi y se concentró con un RNeasy mini kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN extraído se cuantificó espectrofotométricamente.

Experimentos de microarrays de ADN

Los experimentos de expresión génica utilizando microarrays de ADN se realizaron por NimbleGen Systems, Inc.. En resumen, la matriz de todo el genoma de Z. mobilis se diseñó a partir de la fase de lectura abierta (ORF) de la cepa Z. mobilis ZM4. Los arrays se componen de sondas de oligonucleótidos 60-mer con dos repeticiones y 18 sondas únicas por gen (es decir, un total de 36 sondas por gen). El ARN extraído fue probado para la pureza y la integridad, y luego etiquetado con Cy3; la hibridación de microarrays, la adquisición de datos, y la normalización se llevó a cabo por NimbleGen.

Microarray datos de número de entrada

Los datos analizados de microarray en este estudio se han depositado en la Expresión Génica Omnibus (GEO)

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

Los cebadores se diseñaron utilizando Primer-3 software. Las muestras de ARN almacenadas a -80°C (las mismas muestras utilizadas para los experimentos de microarrays de ADN) se utilizaron para la qPCR. La PCR transcriptasa inversa (RTPCR) se realizó usando el One-step qPCR kit, con la siguiente composición: el volumen de reacción total fue de 20 μl de los que 10 μl son de ARN-direct SYBR Green PCR Master Mix en tiempo real, 0,2 mM de cada cebador, 50 mM de Mn (OAc)2, y 20 pmol de ARN total como plantilla. La RT-PCR, incluyendo los pasos de la transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se llevó a cabo usando una ADN polimerasa. Las mezclas fueron primero desnaturalizadas a 95 ° C durante 30 s, y luego se llevó a cabo la RT a 61 ° C durante 20 min. El ciclo de PCR se realizó en 55 ciclos a 95 º C durante 5s, 55 º C durante 10 s, y 74 ° C durante 15 s. Las reacciones se realizaron en un instrumento Light-Cycler de PCR.

Ensayo de la concentración intracelular de peróxido de Hidrógeno

Las células cultivadas hasta la fase logarítmica tardía se recogieron y se lisaron por sonicación. El nivel de peróxido de hidrógeno intracelular se determinó mediante la oxidación de ión ferroso en la presencia de un indicador de ión férrico, naranja de xilenol. Cincuenta litros de extracto celular bruto se añadió a 950 litros de reactivo FOX [100 mM naranja de xilenol (Sigma), sulfato de amonio 250 mM ferroso, 100 mM de sorbitol y 25 mM de ácido sulfúrico]. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min y luego se centrifugó para eliminar cualquier material floculado antes de medir la OD560. La concentración de peróxido de hidrógeno se representa con nanomol por miligramo de proteína.

Resultados

Aislamiento de colonias mutantes con una alta capacidad de fermentación alcohólica bajo condiciones aeróbicas

Las colonias mutantes que poseían una alta capacidad fermentativa alcohólica fueron aisladas y diferenciadas mediante una técnica de cribado en mutantes altamente tolerantes a la glucosa y al alcohol y en varios mutantes resistentes a antibióticos. De estos, la colonia simple altamente resistente a antibióticos y la doble resistente a antibióticos, tendían a mostrar una alta capacidad de formación de colonias en el medio sólido con contenido en glucosa y etanol. Lo sorprendente, es que estas mismas colonias no presentan una tolerancia significante al etanol o la glucosa en comparación con el genotipo silvestre, sino que estos mutantes exhiben una mayor capacidad de producción de etanol bajo condiciones aeróbicas.

Crecimiento y producción de etanol de las colonias mutantes bajo condiciones aerobias y anaerobias

Las colonias más importantes fueron aisladas para mayor investigación, siendo sometidas a condiciones de aerobiosis y anaerobiosis para estudiar su producción de etanol.

Bajo condiciones anaerobias, las colonias mutantes presentaban una producción y un crecimiento similar a las colonias silvestres. Por lo que podemos concluir que no existe diferencia remarcable entre el crecimiento y la producción de etanol bajo condiciones de anaerobiosis entre colonias mutantes y silvestres.

En cambio, podemos observar que las colonias alcanzan un crecimiento máximo en condiciones aerobias. Concretamente, las colonias RDM-4 y RDM-8 mostraban el mayor crecimiento y productividad en medio aeróbico.

Consumo de oxígeno de las colonias mutantes

La evaluación de la respiración se llevó a cabo en un frasco fermentador ligado a un electrodo de Oxígeno disuelto. Todas las colonias mutantes estudiadas presentaron un consumo de oxígeno menor que las colonias silvestres, es decir, mostraron una diferencia respiratoria, por lo que son designadas como rdm. En concreto las RDM-4 y RDM-8 mostraron un consumo de oxígeno extremadamente bajo, de alrededor del 20-30% menos que las silvestres.

Crecimiento y producción de etanol de las colonias RDM bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas a alta temperatura

Bajo condiciones de estrés, se observó que las colonias RDM incrementaban su termotolerancia. Las colonias silvestres crecían a temperaturas de 39ºC, sinembargo, su productividad alcohólica decrecía a esa temperatura. Mientras tanto, todas las cepas RDM mostraron un crecimiento alto y alta producción de etanol, incluso a 39°C, bajo ambas condiciones: anaeróbicas y aeróbicas. Entre ellas, la cepa RDM-4 presentó el mayor índice de crecimiento y productividad.

Es conocido el efecto que tiene el acetaldehído en la inhibición del crecimiento y productividad en el crecimiento aeróbico de Z.mobilis. Sin embargo, este compuesto no fue detectado en ningún cultivo.

Análisis de microarrays ADN de capacidad de fermentación alta en condiciones aeróbicas y termotolerancia de RDM-4

Para investigar cómo las cepas RDM exhiben mayor fermentación de etanol bajo condiciones aeróbicas, se hizo el análisis de microarrays de ADN de la colonia RDM-4: este mutante mostró la mayor deficiencia respiratoria, aun así crece bien a 39 ° C y su producción de etanol es buena en cualquier condición.

La expresión de genes con ARN de las células cultivadas a 30 ° C bajo condiciones de crecimiento aeróbicas se comparó entre los de tipo silvestre y cepas RDM-4 cepas. De ello se concluyó que quince genes fueron transcritos de forma diferente. De ellos, tres estaban relacionados con la biosíntesis de cisteína (metE, cysK y cysD).

La especie Z. mobilis fermenta la glucosa a etanol a través de 3 vías diferentes en los que participan un total de 13 genes. La expresión de estos genes se comparó entre las colonias silvestres y las RDM-4 cultivadas a 30ºC, y la conclusión fue que los 13 genes examinados mostraron mayor expresión en RDM-4 que en la cepa silvestre.

Para confirmar la conclusión del análisis de microarrays se realizó una qPCR para los 13 genes. Los resultados confirmaron que la expresión de los 13 genes es mayor en RDM-4 que en la cepa de tipo silvestre bajo condiciones de crecimiento aeróbicas.

Para examinar el mecanismo de la termotolerancia de cepas RDM, se comparó la expresión de genes en anaerobiosis de la colonia RDM-4 cultivada a alta temperatura y la cepa de tipo silvestre cultivada a la temperatura óptima (30 ° C) bajo condiciones anaeróbicas: un total de 103 genes mostraron cambios significativos.

En el genoma de Z. mobilis ZM4, hay ocho proteínas de choque térmico (HSPs). Estos HSPs no fueron significativamente inducidos por estrés térmico, excepto en uno de ellos. Eso se debe a que los microorganismos poseen ciertos genes para protegerse contra el estrés oxidativo, que incluyen genes antioxidantes que codifican la superóxido dismutasa, la catalasa, la tiorredoxina, y la glutarredoxina.

Además, los genes de reparación del ADN también son inducidos por el estrés oxidativo. Sin embargo, nueve genes antioxidantes y 17 genes de reparación del ADN en Z. mobilis no mostraron alteraciones significativas en la respuesta al estrés por calor, a excepción de 2 genes de reparación.

Nivel de peróxido de hidrógeno intracelular de las cepas RDM bajo condiciones de alta temperatura

Los diversos estudios de S. cerevisiae sugirieron que el estrés por calor provoca estrés oxidativo, que es un factor de estrés importante bajo condiciones de alta temperatura.

Para estimar el mecanismo de termotolerancia de cepas RDM, se midieron los niveles intracelulares de peróxido de hidrógeno de cepas RDM bajo condiciones de alta temperatura. RDM-4 y RDM-8 mostraron niveles significativamente reducidos de peróxido de hidrógeno intracelular.

Estos resultados indican que las cepas RDM, en particular, RDM-4 y RDM-8 sufren estrés oxidativo mucho más bajo que la cepa de tipo silvestre bajo condiciones de alta temperatura.

Conclusiones

Por estos resultados, se ha considerado que la reducción de estrés oxidativo intracelular y la reducción de la acumulación de acetaldehído en las variedades de RMD, produce un aumento en el crecimiento y en la energía que fluye de glucosa a etanol bajo condiciones aeróbicas. El grado de deficiencia respiratoria refleja el crecimiento y fermentación alcohólica, particularmente a altas temperaturas. Adicionalmente, la termotolerancia en las variedades RMD es resultado del estrés oxidativo. Los esfuerzos del equipo científico se centran en la caracterización de los genes y proteínas responsable de la generación de las variedades RMD en Z.mobilis para su futura mejora.