Ethanol fermentation driven by elevated expression of the G1 cyclin gene CLN3 in sake yeast.

El sake es una bebida originaria de Japón que se produce por la fermentación de glucosa y sacarificación del almidón del arroz de forma simultánea.

Sacarificación: Conversión por hidratación de las sustancias sacarígenas en azúcar. Romper polisacáridos para conseguir glúcidos de menos tamaño, se hace con Aspergillus oryzae.

Fermentación: Por levadura perteneciente a la familia de levaduras de gemación de Saccharomyces cerevisiae.

Todas las cepas de sake examinadas aquí exhiben características morfológicas comunes que se observan en mutantes de whisky (whi) que muestran transiciones G1 / S aceleradas. La cepa del sake mostró una menor eficiencia en la detención G1/G0 una expresión elevada del gen G1 ciclina CLN3 durante todo el período de fermentación. Además, la supresión de CLN3 afectó notablemente la tasa de fermentación tanto en el sake como en las cepas de laboratorio. La interrupción del gen Swi6, un coactivador transcripcional responsable de la transición G1 / S mediada por Cln3p, también resultó en una tasa de fermentación menor, mientras que los mutantes whi exhibieron una mejora significativa en la tasa de fermentación, lo que demuestra un papel positivo de Cln3p y su vía de señalización descendente en la facilitación de la fermentación de etanol.  

Materiales

Las cepas de levadura del sake Kyokai y cepas BY4741, BY4742, BY4743, BY4743 Δcln3, Δswi6 BY4743 y BY4743 Δwhi5. La disrupción de los genes Cln3 o Swi6 en K7 se realizó utilizando un método basado en PCR.

Proceso

 Las células de levadura se cultivaron a 25 ° C en medio líquido YPD a continuación, se fijaron. La triple tinción de manoproteínas de la pared celular de levadura, utilizando fluoresceína con concavalina A conjugado con isocianato, de la actina, utilizando rodamina-phalloidi, y de ADN nuclear, usando 4'-6 '-diamidino-2-fenilindol se llevó a cabo como se ha descrito previamente. Las células se observaron bajo el microscopio fluorescente, y las imágenes microscópicas se procesaron automáticamente usando el sistema CalMorph. Se analizaron y caracterizaron, para cada experimento, los fenotipos de más de 200 células individuales. Se realizaron, cinco (para cada cepa sake) o diez (para X2180), experimentos independientes y los 501 valores de los parámetros se calcularon automáticamente para cada experimento. El análisis de componentes principales se realizó utilizando Statistica software.

-Tests de fermentación: Las células de levadura se precultivaron durante la noche en medio YPD a 30 ° C, se inocularon en un medio YPD y fueron entonces incubadas adicionalmente a 30°C durante 5 días sin agitación. La fermentación se controló midiendo el volumen de dióxido de carbono producido. Finalmente se midió el tamaño celular y la densidad.

-Análisis de la citometría de flujo: Las células de levadura equivalente a 2 unidades de DO660 se cosecharon, se fijaron, se lavaron, y se suspendieron en 1 ml del tampón. La suspensión celular se mezcló con 12,5 microlitoros de 100 mg / ml de ARNasa A, se incubó a 50 ° C durante 60 min, se mezcló con 50 microlitros de proteinasa K y se incubaron adicionalmente a 50 º C durante 60 min. Después de la centrifugación, las células se suspendieron en 1 ml de 16 mg / ml de yoduro de propidio (Sigma) en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y se incubaron a 4 ° C durante la noche en la oscuridad. Esta suspensión de células (300 l) se mezcló con 600 microlitros de 8 mg / ml de yoduro de propidio en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y se analizó utilizando un citómetro Epics Elite ESP.

-Ensayo de PCR en tiempo real: El ARN total fue aislado de las células de levadura utilizando el RNeasy Mini Kit y se cuantificó usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (LMS). El cDNA fue sintetizado a partir de 50 ng de ARN total en un volumen final de 20 micorlitros utilizando el equipo RT PrimeScript de reactivos. La mezclas de PCR contenían cDNA , 0,2 micomolar de cebadores y SYBR Premezcla Ex Taq. La PCR cuantitativa en tiempo real específica de genes (qRT-PCR) se realizó usando un LightCycler (Roche), y la expresión de datos se procesó mediante el método de la segunda máxima derivada de la versión del software LightCycler 3,5. El ciclo umbral delta ΔCT se calculó restando el CT del gen ACT1 de la CT del gen CLN3. El valor de ΔΔCT se calcularon restando la ΔCT de la muestra X2180 en fase I de la ΔCT de las muestras individuales. Los doble cambios se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCT (40).

Resultados

Ø  CallMorph

En esta grafica se observan los resultados obtenidos con CallMorph (cada punto corresponde a un experimento) y se aprecia como las cepas de levadura de sake tienen rasgos comunes y la cepa de laboratorio es distinta.

Algunos de los resultados obtenidos más característicos son las yemas y las células de menor tamaño en las cepas de sake que en la de laboratorio, o una mayor proporción de células con yema en las cepas de sake que en X2180.

Observaron  26 nuevos rasgos morfológicos que servirán para buscar nuevas cepas con alta tasa de fermentación.

Ø  RT-PCR

Como se aprecia en la gráfica, gracias a la RT-PCR se observó una mayor presencia del producto de CLN3 en K7 que en X2180

Ø  Disrupción del gen CLN3 y Δswi6

Cuando se produjo la rotura del gen CLN3 y de uno de sus elementos reguladores Δswi6, se pudo observar como la fermentación disminuyó considerablemente

Ø  Análisis del genoma

Analizando el genoma de las cepas de levadura de sake se observaron cuatro sitios mutados aguas arriba de la región promotora y dos polimorfismos no sinónimos en la secuencia de codificación del gen CLN3 en K7, cuya importancia es todavía desconocida.

Conclusión

Se ha detectado una morfología distinta en la levadura del sake y se ha identificado al gen CLN3 como un acelerador de la fermentación ya que se encuentra en mayor cantidad en las levaduras de sake (que tienen una mayor fermentación) que en las de laboratorio y su disrupción disminuye la fermentación.

Estos resultados proporcionan un ejemplo de modificación artificial de las propiedades fermentativas de la levadura por la alteración del gen CLN3, esta tecnología es ampliamente aplicable para el desarrollo y mejora de cepas de levaduras mejoradas en el ámbito de panadería, elaboración de la cerveza y en las industrias de biocombustibles.

Realizado por: Francisco Javier Álvarez, Diego Cuenca, José David Fernández, Dámaso Moreno y Esther Vílchez.