Growth and poliovirus production of Vero cells on a novel microcarrier with artificial cell adhesive protein under serum-free conditions (Aida Costa, Julia Carrillo, Sergio Navarro, Andrés Marco, Adrián Lázaro).

PRODUCCIÓN DEL POLIOVIRUS POR CÉLULAS VERO EN UN NUEVO MICROPORTADOR 

Autores del artículo: Masato Kurokawa y Shigehiro Sato.

Palabras clave: poliovirus, células Vero, microportador, DSAP, tasa de infectividad.

Contexto:

La poliomielitis  es una enfermedad contagiosa, producida por el virus de la polio, que afecta principalmente al sistema nervioso. Se transmite de persona a persona a través de secreciones respiratorias o por la ruta fecal-oral.

La mayoría de las infecciones son asintomáticas, pero el virus puede entrar al sistema nervioso central por la corriente sanguínea, destruyendo las neuronas motoras y causando debilidad muscular y parálisis flácida aguda. Es una enfermedad muy infecciosa, pero se ha erradicado en la mayor parte del mundo gracias al empleo de dos tipos de vacuna.

La primera consiste en una dosis inyectada de poliovirus inactivados o muertos (IPV), mientras que la segunda consiste en el uso de poliovirus vivos atenuados (OPV). Los virus son cultivados en células huésped llamadas “células Vero”, provenientes de tejido epitelial renal de mono. La OPV es mejor para prevenir la transmisión de la enfermedad a otras personas pero puede provocar la propia poliomielitis, por lo que es más recomendable la IPV.

Introducción:

El experimento consiste en el crecimiento y la producción del poliovirus por células Vero en un nuevo microportador, usando un polímero poliacrílico superabsorbente y uniendo PnF, una proteína celular adhesiva artificial sintetizada por Escherichia coli mediante ingeniería genética, y bajo condiciones de suero libres.

Los microportadores consiguen un aumento de la superficie y están constituidos por dextrano  y poliestireno. El dextrano es un polisacárido que se presenta hinchado por su propiedad absorbente de agua. Sin embargo, el uso de un polímero poliacrílico aumenta dicha absorción, consiguiéndose un tamaño medio de partícula de 250μm.

El dietilaminoetil (DEAE) y el colágeno son modificadores de superficies para microportadores, haciendo más eficiente el crecimiento. El DEAE carga positivamente la superficie aumentando la atracción y el colágeno incrementa la adhesión. No obstante, el colágeno es una sustancia de origen animal que puede originar contaminación por patógenos. Cytodex 3, un compuesto de perlas de dextrano recubiertas con colágeno porcino, se utilizó como el microportador control. Dentro de las proteínas celulares adhesivas no derivadas de animales, útiles para el crecimiento celular en un medio de suero libre, PnF era especialmente superior frente al resto de proteínas recombinantes.

Métodos para el cultivo de células y la producción del virus:

Tras la obtención de DSAP (DEAE unido al polímero superabsorbente) y de DSAP-PnF se prepararon 3 medios de cultivo: VSP-SFM (suero libre) y microportadores de DSAP; VSP-SFM (suero libre) y microportadores de DSAP-PnF; VSP-SFM (suero libre) y microportadores de Cytodex 3 como control.

Posteriormente, las células se incubaron mientras se agitaban a 30 rpm durante 8 días. En el día 6 del cultivo, la mitad del medio se intercambió por medio nuevo. En los días 2, 4, 6, y 8 se realizó una observación microscópica de las condiciones celulares sobre microportadores y una determinación del número de células. El recuento se realizó con un hemocitómetro, una vez el núcleo de las células había sido teñido con violeta cristal (CV) y con azul tripano (TB), obteniéndose los mismos resultados para las dos tinciones. Al día 8 el virus de la polio se inoculó en el cultivo y se continuó su incubación hasta los días 12 y 16, días en los que se extrajeron alícuotas que se congelaron hasta su uso.

Resultados:

Optimización de la densidad PnF:

El número de células Vero se midió tras la incubación durante 6 días, en la que se empleó DSAP y PnF-DSAP con diferentes cantidades de PnF (Fig. 1). El número de células tendía a aumentar con el incremento de  la concentración de PnF en la superficie de los microportadores, alcanzándose una meseta alrededor de 1 μg/cm2.

Figura 1:

Caracterización de microportadores:

Se evaluaron las propiedades físicas de DSAP y PnF-DSAP, utilizando Cytodex 3 como microportador control. Los primeros se obtuvieron a partir de un polímero poliacrílico superabsorbente mientras que el segundo se obtuvo a partir de dextrano. La densidad de partícula, el diámetro y el potencial zeta eran similares. No obstante el volumen de absorción testado mediante un hinchado con solución salina fue mayor con DSAP y PnF-DSAP, como se observa en la siguiente tabla.

Además se visualizó la presencia de PnF en PnF-DSAP con el anticuerpo fluorescente monoclonal anti-PnF. Se concluye que PnF-DSAP generó mayor fluorescencia a medida que aumenta la densidad PnF.

El crecimiento celular y la producción de virus:

Se utilizó PnF-DSAP y Cytodex 3 para la medición del número de células Vero en los días 2, 4, 6 y 8 de incubación. Los resultados se muestran en la figura 4. No hubo una diferencia significativa en el número de células entre los dos cultivos de microportadores en el día 2 de incubación. Sin embargo, fue significativamente mayor en el cultivo con PnF-DSAP que con Cytodex 3 en el día 4 y posteriores.

Las imágenes de cada microportador obtenidas con un microscopio de inversión en los días 2, 4, 6 y 8 de incubación se muestran en las Figs. 5 y 6 (PnF-DSAP y Cytodex respectivamente).

                                 Figura 5:                                     Figura 6:

A partir del día 12 de incubación las células empezaron a lisarse como consecuencia del crecimiento vírico (fig. 5 y 6). Los resultados de la producción del virus de la polio se muestran en la Tabla 2. La tasa de infectividad del virus de la polio con PnF-DSAP fue mayor que con Cytodex 3 en un 40% aproximadamente en el día 12 y en un 30% en el día 16.

Discusión:

Para la fabricación de vacunas contra la polio y otras enfermedades se solían utilizar cultivos de microportadores en medio con FBS (suero bovino fetal). No obstante, en los últimos años se ha recurrido a suero exento de derivados animales. Además, los microportadores comúnmente utilizados (como Cytodex 3) están siendo sustitui0scn dos por nuevos modelos. Comparando el microportador propuesto con Cytodex 3 observamos las siguientes ventajas:

-El uso de un polímero poliacrílico superabsorbente en un microportador aumenta el tamaño de partícula y en consecuencia la superficie de cultivo.

-Se observó una mejora del crecimiento de las células Vero por la presencia de PnF en los microportadores, puesto que la forma de la célula es controlada por la densidad de PnF.

Estos hallazgos sugieren que los PnF-DSAP aportan una mayor superficie de cultivo a la vez que reducen el área de adhesión necesaria para el desarrollo individual de una célula Vero en comparación con Cytodex 3. Todo ello se traduce en una mayor productividad celular e infectividad del poliovirus.

En vista de estos resultados podemos concluir que los investigadores han desarrollado un microportador para el desarrollo de vacunas más eficiente que Cytodex 3, siendo el medio de cultivo utilizado suero libre de compuestos animales.

Referencias bibliográficas:

-         Wikipedia.

-         CDC (centro de control y prevención de enfermedades).

-       “Med line plus”.

-         Artículo sobre el poliovirus “Growth and poliovirus production of Vero cells on a novel microcarrier with artificial cell adhesive protein under serum-free conditions”.