Utilización de la biomasa agrícola en la producción del biopolímero schizophyllan

Introducción

Schizophyllan es un polisacárido producido por el hongo Schizophyllum commune. Es utilizado para usos farmacológicos en vacunas y terapias contra el cáncer, puesto que se trata de un estimulador de la respuesta inespecífica del sistema inmune. Además de utilizarse como ingrediente en diversos cosméticos. Sin embargo, schizophyllan tiene una serie de propiedades físicas, tales como su alta viscosidad, la formación de films y su resistencia a la temperatura que lo hacen un candidato ideal para nuevos biomateriales.

La producción de este biopolímero ha estado ligada a la utilización de glucosa como fuente de carbono y disponible solo en pequeñas cantidades, puesto que debe ser purificado para los usos tradicionales antes mencionados.

La utilización de una fuente de carbono más barata que la glucosa, como puede ser la biomasa agrícola, podría reducir los costes de producción de schizophyllan. De esta manera, la producción de polímeros derivados de la utilización de la biomasa agrícola podrían suponer una alternativa viable para las refinerías de petróleo y a los productos derivados del mismo.

Como hemos dicho antes, la glucosa es el principal azúcar utilizado en la producción de schizophyllan, el hongo del que proviene puede utilizar un número de azúcares muy diversos (así como el almidón). Esto es posible gracias a que S. commune produce una serie de enzimas tales como hidrolasas, xilanasas y celulasas, las cuales puede utilizar directamente sobre la biomasa.

Aquí se comprobarán y compararán los diferentes sutratos que puede utilizar S. commune y que son derivados de la producción agrícola: fibra de maíz y fibra de maíz pretratada, subproductos de destilería con solubles (DDGS) los cuales no son más que residuos del cereal una vez extraída la parte amilácea para ser fermentada para producir etanol, y la cáscara de la soja. Además se determinarán las condiciones para una eficiente producción de schizophyllan bajo estas diferentes fuentes de carbono.

Materiales y Métodos

Sustratos de biomasa agrícola y medios de cultivo: como sustratos se utilizan DDGS de maíz, cáscaras de soja y fibras de maíz (con o sin pretratado con peróxido de hidrógeno alcalino). La biomasa está suspendida en extracto de levadura (levadura, KH₂PO₄, MgSO₄) o de malta (malta, peptona).

Variedades y condiciones de cultivo: se utiliza Schizophyllum commune ATCC 38548 cultivado en agar de malta a 28ºC. Hacer un preinóculo en medio de levadura cultivado durante 5 días y luego inocular en el medio final durante 14 días.

Aislamiento del polisacárido: homogeneizar el medio y recoger el sobrenadante. Resuspender el precipitado y repetir. El precipitado final se seca por aspiración. Agregar etanol al medio para precipitar el polisacárido por centrifugación y luego secar.

Análisis de la composición de la biomasa: hidrolizar la biomasa con 2 N trifluoroacético (TFA), filtrar la mezcla y resolver los azúcares por cromatografía de alta resolución (HPLC) eluída con ácido nítrico.

Composición glucídica del esquizofilano: hidrolizar el esquizofilano con 2 N TFA y añadir hidroxilamina piridina y anhídrido acético. Analizar la capa orgánica mediante cromatografía de gases y espectrofotometría de masas.

Análisis de la unión del schizophyllan: disolver el polisacárido en dimetil sulfóxido y añadir yoduro de metilo e hidróxido anhídrico de sodio (proceso denominado permetilación). Extraer la capa orgánica con cloroformo, hidrolizar, acetilar y analizar con cromatografía de gases y espectrofotometría de masas.

Análisis por RMN: obtención del espectro con instrumentos estándar y uso de dimetil sulfóxido deuterado como disolvente.

Determinación de pesos moleculares: disolver el polisacárido en agua nanopura y aplicar en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño de alta resolución eluída con nitrato de sodio.

Viscosidad de la disolución: uso de un reómetro de tensión controlada con las configuraciones de barridos dinámicos de frecuencia y barridos de ritmo constante.

Actividad de superficie: uso de un instrumento de tensión de superficie.

Producción de schizophyllan a partir de biomasa agrícola

Se comparan cuatro sustratos, además de dos medios básicos diferentes:

•          Yeast extract medium (YE) o medio con extracto de levadura: se usa normalmente para la producción de schizophyllan con glucosa.

•      Malt extract medium (ME) o medio con extracto de malta: se usa para preparar el preinóculo de S. commune.

Se midió el rendimiento de producción de schizophyllan a partir de cada sustrato y el rendimiento de la biomasa total a los 14 días. La biomasa total incluye el peso de los residuos del sustrato insolubles y la biomasa del hongo.

En cuanto a rendimiento de la biomasa del hongo se observó lo siguiente:

En YE, el rendimiento de la biomasa total muestra una pérdida de peso, sugiriendo que los cuatro sustratos se usan en cierto grado (fig. 1A). El crecimiento del hongo fue evidente con sustratos añadidos; pero no hubo ningún aumento o acumulación de biomasa total en cultivos sin fuente de carbono añadida (fig. 1A).

Figura 1A

En ME, los cultivos mostraron aumentos y/o disminuciones secuenciales de biomasa total, reflejando diferencias en la solubilidad de los sustratos y en el crecimiento del hongo (fig. 1B). Además un aumento de la biomasa total de cultivos tardíos puede reflejar también una reutilización del schizophyllan producido hasta ese momento. Además, el S. commune mostró crecimiento en medios con ME y adición de glucosa, e incluso en ME sin adición de fuente de carbono (fig. 1B).

Figura 1B

En cuanto al rendimiento de polisacáridos extracelulares se obtuvo lo siguiente:

En YE, S. commune produce un máximo rendimiento a partir de fibra de maíz pretratada de aproximadamente 2.2g/l de polisacárido extracelular el día 6, y a partir de DDGS de aprox. 1.1g/l de polisacárido el día 4 (fig. 1C). Los rendimientos máximos de producción de polisacáridos extracelulares a partir de fibra de maíz no tratada, cáscaras de soja y controles (sin fuente de carbono) fueron aprox de 0.5g/l el día 8, 2 y 12, respectivamente.

Figura 1C

Los cultivos de S. commune en medios ME tienen mucho más rendimiento de producción de polisacáridos extracelulares que los de cultivos en YE (fig. 1D). En ME, los cultivos con fibra de maíz no tratada o glucosa produjeron rendimientos similares de 10.8g/l de polisacárido los días 8 y 10, respectivamente. Los de fibra de maíz pretratada produjeron aprox. 18.5g/l el día 14, mientras que los cultivos con DDGS produjeron 15.4g/l el día 8. Los cultivos sin fuente de carbono añadida produjeron 7.4g/l el día 14, presuntamente reflejando la contribución de la maltosa en el extracto de malta. Es interesante ver que los cultivos crecidos en cáscaras de soja en ME produjeron muy poco polisacárido (rendimientos máximos de 0.9 g/l el día 4), mucho menos que los medios ME sin sustratos añadidos. Esto sugiere que las cáscaras de soja son de hecho inhibitorias de la producción de schizophyllan.

Figura 1D

Aunque la fibra de maíz pretratada produjo altos rendimientos de polisacárido, el DDGS es el sustrato más prometedor para la producción de schizophyllan, porque el pretratamiento de la fibra de maíz añade un coste considerable al proceso. Los rendimientos máximos ocurrieron además más pronto (día 8) en DDGS que en la fibra de maíz pretratada (día 14), ganando tiempo de producción.

Efecto de los componentes del medio para la producción con DDGS en ME de schizophyllan

Tras varios experimentos podemos observar que S. commune no puede crecer en ausencia de extracto de malta ni peptona. Por lo tanto, parece que el medio basal estándar  ME con DDGS es  particularmente adecuado para la producción de schizophyllan.

Caracterización química del schizophyllan producido a partir de DDGS

Es necesario realizar caracterizaciones estructurales de los polisacáridos extracelulares obtenidos en este estudio, para diferenciar el schizophyllan producido de novo por S. commune del almidón y el arabinoxilano liberado por las enzimas del microorganismo al degradar el DDGS en ME.

Se analizaron los polisacáridos extracelulares primero por un análisis GC/MS (Cromatografía de Gas-Espectrofotometría de masas) tras hidrolizarlos (fig. 2), y tras esto por RMN, y los resultados que se obtuvieron fueron comparados con el schizophyllan comercial (fig. 3A y 3B). Los resultados obtenidos eran prácticamente iguales para las dos muestras revelando que el polisacárido aislado era el schizophyllan. Los resultados de la RMN fueron confirmados al realizar el análisis de unión mediante permetilación.

Figura 2

           Figura 3A

Figura 3B

Caracterización física del schizophlan producido a partir de DDGS

Mediante HPSEC (High Pressure Size Exclusion Chromatography) se determinó el peso molecular del polisacárido producido a partir de DDGS en ME y se obtuvo un valor similar al obtenido para el schizophyllan comercial.

Éste mostró el mismo flujo seudoplástico (decrece la viscosidad cuando aumenta la velocidad de cizalla) que el comercial. De igual forma también se observó que las disoluciones de schizophyllan tienen muy poca o ninguna tensión superficial.

Figura 4

De los resultados obtenidos podemos afirmar que el schizophyllan producido a partir de biomasa y en particular de DDGS es una alternativa barata y eficiente al comercial. Esto supondría la reducción del coste de la producción de biomateriales como biofilms degradativos y mejorar la recuperación del petróleo.

Título:

Utilization of agricultural biomass in the production of the biopolymer schizophyllan

Autores:

Nongnuch Sutivisedsak, Timothy D. Leathers, Melinda S. Nunnally, Neil P. J. Price, Girma Biresaw

Publicado en Springer-Verlag el 23 de octubre de 2012

Marina Bernabéu Cantó

Víctor Marín Delgado

Samanta Ortuño Miquel

Cynthia Pardines Candela

Alejandro Ruiz Bayón