Diversidad genética, dinámica, y actividad de la comunidad de Lactobacillus relacionada con la producción artesanal del queso manchego.

Genetic diversity, dynamics, and activity of Lactobacillus community

involved in traditional processing of artisanal Manchego cheese

Isabel Sánchez, Susana Seseña, Justa M. Poveda, Lourdes Cabezas, Llanos Palop 


Trabajo realizado por: Carlos Menor Ferrándiz, Mateo Leal Ferrández, Adrián García Sirera, Germán Antón Ruiz y Antonio Joaquín Lozano

INTRODUCCIÓN

El queso manchego es un queso español elaborado con leche de oveja de raza manchega, que está adaptada a la explotación del pastoreo en zonas áridas y protegido por una denominación de origen en La Mancha. La leche para elaborarlo puede ser cruda o pasteurizada. El  queso puede ser de dos tipos: prensado y duro (en función de su forma de preparación)

También puede clasificarse en tres tipos atendiendo a su grado de maduración: fresco, semicurado y curado.

El proceso de elaboración del queso manchego sigue las siguientes etapas: 

• Ordeño y refrigeración de la leche
• Coagulación y corte de la cuajada
• Desuerado
• Moldeado
• Identificación 
• Prensado
• Volteado
• Salado
• Secado y maduración

La pasteurización previa de la leche será obligatoria para aquellos quesos de tipo frescos y los que se consuman antes de los dos meses tras su elaboración. 

Es básico para elaborar un queso realizar la cuajada. Es el único proceso necesario y consiste en separar los componentes de la leche, por acción de la temperatura o bacterias. 

La separación se logra desestabilizando la proteína de la leche (caseína). Este desequilibrio hace que las proteínas se aglutinen en una masa blanca, separándose del líquido (suero lácteo). 

Las bacterias utilizadas (Lactococcus sp, Lactobacillus sp, etc.) junto con las enzimas que producen y la leche de orígen, serán determinantes en el sabor del queso tras su añejamiento. Para elaborar quesos duros, se somete a la cuajada a temperaturas entre 33ºC y 55ºC, para que se deshidraten más rápido.ç

Como curiosidad, cabe destacar que las exportaciones de queso manchego certificado por la Denominación de Origen Queso Manchego ascendió durante 2011 a cerca de 10,4 millones de kilos frente a los 9,7 certificados en 2010, lo que supone un aumento de más del siente por ciento. El total de queso manchego exportado aumentó un 16,6 por ciento respecto a 2010, pasando de cuatro millones de kilos a 4,7.

La exportación a países de la Unión Europea creció el 13,7%, y un 18,9% a países comunitarios, ha informado la Denominación en nota de prensa. De nuevo Estados Unidos se constituyó en el primer destino exterior, con un total de 2,1 millones de kilos. También ha experimentado un notable avance la exportación a países de la UE.

OBJETIVO E HIPÓTESIS DEL TRABAJO

El siguiente artículo trata de intentar estudiar la composición de las NSLAB en los quesos manchegos. Para ellos se propuso caracterizar la comunidad natural de cepas de bacterias del ácido láctico presentes en las distintas etapas de la elaboración de estos quesos.

En la producción del queso, distinguimos dos variedades de bacterias: aquellas que se introducen al principio del proceso (iniciadoras o "starter"), y las NSLAB o bacterias del ácido láctico no iniciadoras. La presencia de las NSLAB se encuentra más allá del control del fabricante, e introduce una variabilidad en el proceso que induce sobre todo diferencias en sabor y la calidad entre distintos quesos de la misma variedad. Su origen puede variar, entrando en el proceso con la leche, con los ingredientes utilizados en la fabricación de queso, desde los alrededores...

MÉTODOS Y MATERIALES 

1      Muestreo de queso:

     Dos queserías de Castillas la Mancha (una de ellos con el premio “Gran selección”) a las que denominamos C y N. En cada quesería, se produjeron dos lotes de quesos (CA, CB, NA y NB) a partir de la misma leche cruda.

Para la producción de queso se añadió a la leche un iniciador comercial liofilizado de baja concentración (1% m/v) que contiene: Lactococcus lactis subsp. lactis, L. lactis subsp cremoris y Streptococcus thermophilus.

El queso fue madurado en las queserías bajo las condiciones tradicionales y transportado al laboratorio.

Por cada lote, se analizaron: la leche utilizada, la cuajada (cogida inmediatamente después del moldeado (día 0)), y quesos madurados durante 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32 y 48 semanas. La quesería N paró la maduración antes de las 48 semanas, por lo que no hay datos sobre esa muestra.

2    Aislamiento y agrupación de las bacterias del ácido láctico:


     Para la enumeración de los grupos microbianos, se utilizaron 4 medios de cultivo diferentes con sus condiciones de incubación, y cada análisis fue realizado por duplicado.


        5 colonias fueron tomadas al azar de cada placa, por cada medio y por cada muestra de cada lote. Estas colonias fueron consideradas como representantes de las cepas numéricamente dominantes presentes en el queso en cada etapa de la maduración. Estas cepas fueron subcultivadas.


      Se utilizó para este experimento una selección de cepas de L. plantarum, L. paracasei subsp. paracasei, L curvatus y L. pentosus, identificadas y genotipadas previamente utilizando la técnica RAPD. 


      Identificación de las cepas de Lactobacillus sp: 


      Para identificar estas cepas se realizaron: tinción de Gram, la prueba de la catalasa, morfología celular, producción de amoniaco a partir de arginina, y producción de dióxido de carbono a partir de glucosa. De 628 cepas aisladas, solamente el 33,5% fueron identificadas como Lactobacillus sp. 


     Amplificación por PCR:

Se extrajo ADN de cada cepa. Se utilizaron dos cebadores de secuencia arbitraria, realizando las amplificaciones por separado para cada cebador. 

·      

La técnica RAPD-PCR fue realizada utilizando extracto de DNA, cebador, dNTP, tampón Taq Mg, KCl, ((NH₄)₂SO₄), Taq polimerasa y agua. Las PCR se llevaron a cabo en un PTC-100 Thermal Cycler.

Los productos de la PCR fueron analizados mediante electroforesis, utilizando como marcador de peso molecular Lambda DNA cortado con PstI.

Las fotografías que fueron tomadas del gel fueron digitalizadas para el análisis. Se utilizo el programa GelCompar 4.0 para comparar los diferentes geles.

La similitud de los resultados fue expresada por el coeficiente de correlación de Pearson (r), y fueron agrupadas por el método UPGMA (unweighted pair group method with arithmetical average).

Los trazos densitométricos obtenidos usando los dos cebadores fueron ensamblados para producir un único trazo densitométrico combinado para cada cepa y entonces es analizado como un patrón acumulativo de ADN,  dando un único dendograma de similitud.

La calidad del análisis de grupos fue verificando calculando el valor de correlación confenética.

Para el nivel de semejanza (r) se estableció un umbral de discriminación debajo de el cual los patrones son considerados diferentes.

Caracterización fisiológica: 

Se realizaron pruebas de acidificación y actividad enzimática, incubando cepas en leche y midiendo los resultados mediante un espectofotómetro. 

DISCUSIÓN DE RESULTADOS 

 En esta gráfica visualizamos los resultados de la RAPD-PCR. Podemos observar los dos geles obtenidos por cada cebador y por cada cepa. El programa los agrupa según su similitud entre ellos y con las cepas modelo que se han comentado antes. Una similitud de un 90% indica que pertenecen a la misma cepa, y una similitud de un 54% indica que todas esas cepas pertenecen a la misma especie.

Estos dos gráficos representan la distribución de las especies identificas previamente en las distintas muestras tomadas en diferentes etapas de la producción de queso. 

La evolución es muy similar en ambas: 

- Observamos L. acidophilus en la leche o en el cuajo inicial en ambos quesos. 

- L. plantarum predomina durante la maduración del queso de manera similar en ambas queserías. 

- L. brevis y L. paracasei subsp. paracasei también siguen una dinámica parecida. 

Pero también observamos algunas diferencias como por ejemplo en la leche utilizada, en la que la quesería N la leche solo contiene L. paracasei subsp. paracasei, mientras que la leche utilizada en C contiene mas especies. 

En esta imagen prácticamente se puede corroborar lo que hemos interpretado las gráficas referentes a la dinámica de la población. 

                                                                            

Con respecto a los resultado que se obtuvieron en las pruebas de acidificación y actividad enzimática, cabe destacar que:

- L paracasei subsp. paracasei es la más acidificante y L. pentosus la menos acidificante.

- L. brevis es la que más actividad proteolítica mostró y L. plantarum y L.fermentum las que menos.

- L. curvatus mostró una actividad peptidasa muy débil, y la mayoría no mostró actividad.

- Las cepas mostraron mayor actividad en ácidos grasos cortos que en ácidos grasos largos. L. fermentum presentó la mayor actividad esterasa y L. plantarum la menor.

4 Conclusiones

De los resultados obtenidos se puede concluir que, a pesar de las diferencias entre las muestras de las dos industrias lácticas en cuanto a la composición de la comunidad natural de los Lactobacillus implicadas en la maduración del queso manchego.


3 especies: L. plantarum, L. paracasei subsp. paracasei y L.brevis predominaron sobre la microflora de Lactobacillus, con una sucesión idéntica durante la maduración. Eso sugiere que están bien adaptados al entorno del queso Manchego y las restricciones del queso curado.

Estas pequeñas diferencias en la población de Lactobacillus no son esenciales para la producción de queso manchego, aunque sí que pueden causar variaciones en el sabor y en el aroma entre los quesos de las diferentes industrias.

Los datos de la genotipación mostraros que la maduración fue dominada por un numero limitado de genotipos, a pesar de la detección  de una diversidad de genotipos en alguna de las etapas.

A pesar de todos los aislamientos realizados durante la producción de productos lácticos, se encontraron diferencias en la caracterización fisiológica.

A vista de los resultados obtenidos en el experimento, los genotipos Q14C, Q42C y Q35N de L. paracasei subsp. paracasei, L. brevis y L. fermentum respectivamente, fueron elegidas como cultivos relacionados con la obtención de la Denominacion de Origen Manchego. Estas cepas fueron obtenidas en quesos provenientes de la industria C, quesos con excelentes características sensoriales.


Enlaces de interés: 


Presentación seguida durante la exposición:


https://dl.dropbox.com/u/83970128/PPT%20final%20%28definitivo%29.pptx


Artículo a partir del cual se ha realizado el trabajo:


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