Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

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martes, 27 de mayo de 2014

Activación de la producción de indigoidina, un pigmento azul silenciado en Photorhabdus luminescens



En la naturaleza se pueden encontrar multitud de microorganismos que tienen algunos de sus genes silenciados, los cuales podrían servir para encontrar enzimas que sintetizarían nuevas curas para muchas enfermedades. Por eso, el objetivo de este artículo ha sido encontrar algunos mecanismos para activar estos genes. En este caso, se ha utilizado la producción de indigoidina, un pigmento de un color azul muy diferenciable, lo que facilita así su observación en los distintos experimentos en Photorhabdus luminescens. Eligieron este microorganismo dado que en él, el gen de la indigoidina esta silenciado.
En un análisis de la cepa TT01 de P. luminescens, se han encontrado, tres sintetasas de indigoidina homólogas a la de otro organismo que sí que la produce (Erwinia chrysanthemi) las cuales son: IndA, IndB e IndC.

Se llevaron a cabo varios experimentos:


PRIMER EXPERIMENTO

Este experimento lo realizaron para comprobar si IndC es funcional y se llevó a cabo en E. coli. Antes de todo IndCA fue clonado con su promotor en puC18. Lo primero que hicieron fue crear un vector que solo contenía IndCA y observaron que no daba ningún color, por lo que concluyeron que no había producción de indigoidina. A continuación, introdujeron el vector IndCA con otro vector pSumtaA que sí que mostraba una pigmentación azul. Por último quitaron el vector IndA y vieron que con sólo IndC + mtaA se seguía observando dicho color. Por eso pudieron concluir que IndC es funcional (aunque esté silenciado) y que indA e indB no son esenciales para la biosíntesis de indigoidina.




SEGUNDO EXPERIMENTO

Una vez que comprobaron que IndC era funcional, quisieron inducir la producción de indigoidina en P. luminescens, en el cual está silenciado, para ello insertaron un vector. El vector fue usado con uno de los dos promotores fuertes (rspM y cipB).
La primera construcción que realizaron (vector + promotor) estaba constituida por el promotor más fuerte, rspM, y obtuvieron un color azul intenso. La segunda construcción estaba constituida por el promotor cipB y vieron que mostraba un color menos intenso y algo rojizo, debido al alto contenido de antraquinonas. Con estos resultados concluyeron que usando dos promotores fuertes, se puede activar la producción de indigoidina.








TERCER EXPERIMENTO

Por último, crearon un vector vacío, y lo insertaron en E. coli, el cual permitía controlar el experimento. Esta es la primera construcción, la cual sí que dará color azul. La segunda construcción consistía en el mismo vector al que se le han introducido 6 genes (plu2180-plu2185) implicados en la biosíntesis de indigoidina, y observaron que no da color azul. A partir de esto, fueron eliminando los 6 genes por separado, para ver el efecto de cada uno. Al delecionar el gen 2185 da color azul, por lo que pudieron afirmar que este gen es un inhibidor en la producción de indigoidina.




Para ver si estos genes también influían en P. luminescens, introdujeron un vector con una deleción de los 6 genes. Como no se observaba ninguna coloración, a diferencia de en E. coli, dedujeron que E. coli y P. luminescens tienen diferentes mecanismos de regulación.

CONCLUSIÓN

Por todo lo anterior concluyeron que estos experimentos van a ser útiles para activar genes silenciados o crípticos, los cuales podrían llegar a servir para encontrar enzimas que sintetizarían nuevas curas para muchas enfermedades.


Bibliografia:
-       Appendix A. Supplementary data
-       Biología de los Microorganismos, Brock 10ª Edición


Realizado por:
Carolina Mirete Juan
Ana Sala Pérez
María Sempere López
Laura Ruiz Pacheco
Laura Cuenca Rico


3 comentarios:

  1. Habéis duplicado el título. Aparece dos veces


    La frase "podrían servirnos para estudiar algunas enfermedades" debería ser "podrían servirnos para encontrar enzimas que sintetizarían nuevas curas para muchas enfermedades" ya que en el artículo lo que pone es "enzymes that synthesize cures for many diseases".


    Por enésima vez, no abusar de la 1ª persona, así que eliminar frases del estilo "A continuación introducimos..." y similares. Estáis describiendo el trabajo experimental de otras personas.


    El texto es de difícil comprensión. En vuestra exposición oral se entendía bastante bien el qúe querían hacer. El por qué querían hacerlo y el cómo lo habían hecho. En este texto, las dos primeras preguntas más o menos están contestadas en la introducción pero la tercera no. La descripción de los experimentos no tiene ningún tono divulgativo. Creo que esto lo lee un estudiante de 1º de Biotecnología y no lo entendería. Resumir de manera divulgativa un artículo no quiere decir que utilicéis frases telegráficas para describir una serie de experimentos anotando detalles que al lector probablemente no le indique nada y quizás le confunda aún mas.


    No hay casi enlaces en el texto, tan sólo uno a P. luminiscens. Podríais haber puesto uno a la indigoidina.


    La abreviatura del género va separada de la del nombre de especie. Se escribe E. coli no E.coli


    La ficha bibliográfica debe de dar toda la información del artículo, no solo el enlace. Adicionálmente, lo correcto sería decir "Bibliografía" porque "ficha" hace referencia a una sola cosa, no a un conjunto.


    No habéis puesto etiquetas

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    1. Hemos corregido los errores que nos has indicado, cambiado la primera persona, intentado hacerlo más divulgativo y cambiado los errores de los nombres científicos que no nos habíamos dado cuenta, puesto las etiquetas y más enlaces.
      Un saludo

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  2. Efectivamente habéis mejorado el estilo divulgativo, pero cualquier lector se va a seguir planteando cosas como “¿y por qué usan E. coli y no lo hacen todo con P. luminiscens?”. Lo importante no es describir cómo han conseguido meter esos genes en E. coli, sino describir porqué se hace primero en E. coli. Se hace en E. coli porque es mucho más fácil de manipular genéticamente y de esa forma se comprueba que la proteína IndC de P. luminiscens funciona perfectamente. Una vez que han comprobado que IndC funciona lo que hacen es un experimento para ver si pueden activar su expresión en P. luminiscens utilizando otro tipo de promotores. Descubren que sí. Finalmente se plantean usar el sistema de síntesis de indigoidina en E. coli para identificar si hay genes de P luminiscens que podrían intervenir en la regulación de dicha síntesis. Y así encuentran uno (el plu2185)

    El “vector vacío“ es el control experimental negativo que les permite saber si el sistema está funcionando correctamente o si tiene alteraciones debidas a las técnicas de manipulación genética. No es algo que “permitía controlar el experimento”.

    Insisto, debéis poner la ficha bibliográfica del artículo tal y como se os enseño en el ejemplo de las practicas de informática de la asignatura

    Tenéis dos párrafos pegados en la introducción

    Es pUC18, no puC18

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