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miércoles, 28 de mayo de 2014

Ingeniería genética para mejorar la producción de ácido 2-ceto-L-gulónico en Ketogulonigenium vulgare

Objetivos & introducción

Como objetivo principal de este estudio, los investigadores pretenden mejorar la densidad celular y la producción de ácido 2-ceto-L-gulónico (2-KGA) mediante la introducción de genes de la ruta de biosíntesis de folato en Ketogulonigenum vulgare.
Los derivados del folato son esenciales en el crecimiento en cultivo mixto de las especies Bacillus megaterium y Ketogulonigenium vulgare, cultivos que se llevan a cabo para la producción de 2-KGA, precursor del ácido L-ascórbico(L-AA), llamado también vitamina C (Vc). Estos cultivos sustituían a los procesos de síntesis química que anteriormente se llevaban a cabo, pero los autores quisieron ir más allá. Estos cultivos mixtos presentaban algunos inconvenientes como la complejidad del proceso, su manipulación sin sufrir contaminación o dificultad en la optimización del proceso de producción. Para solventar este problema, los autores propusieron la ingeniería genética en K. vulgare para mejorar la síntesis de 2-KGA, basándose en estudios anteriores que demostraban su eficacia.

Síntesis de cepas mutantes

Las cepa que se utilizó fue K. vulgare DSM 4025 como cepa silvestre. A partir de la silvestre, se formó el mutante K. vulgare Rif, resistente a la Rifampicina. Dicha resistencia se requiere como uno de los marcadores selectivos para la introducción del plásmido de expresión a través de la conjugación con Echerichia coli. La siguiente cepa que se utilizó fue K.vulgare Rif con el plásmido pBBRMCS-2. Esta cepa se consideraba control, ya que no contenía en el plásmido los genes para la biosíntesis del folato. Por último, K. vulgare Rif pMCS2PsdhfolBC, cepa que sí contenía en el plásmido los genes para la biosíntesis de folato. Este grupo de genes son: FolB, FolKE, FolP, FolQ y FolC, los cuales se clonaron y se añadieron aguas abajo del promotor pSDH. Todos los plásmidos utilizados fueron transformados en E. coli S17-1 por electroporación, técnica que consiste en el aumento significativo de la conductividad eléctrica. Esto hace que produzca una alteración en el potencial eléctrico de la membrana y se generan los poros. Estos poros permiten el paso de partículas de ADN.

Ensayos

En primer lugar, para verificar la funcionalidad de los genes que se expresan, se llevó a cabo un ensayo microbiológico sobre el folato. 24 horas antes del ensayo, las cuatro cepas distintas se cultivaron en un medio HJ. Este medio se modificó a partir del estudio Fue et al, siendo su contenido1.5% de L-sorbosa, 0.25% de MgSO4 · 7H2O, extracto de levadura un 0.5%, 1.5% de peptona y 0.5% de urea; todo a un pH de 7.0. La cepa silvestre K. vulgare DSM4025, la cepa mutante K. vulgare Rif y las cepas recombinantes que albergaban los plásmidos pBBR1MCS-2 y pMCSPsdfolBC se cultivaron en ese medio.
 La concentración de folato en la cepa recombinante que contiene los genes necesarios para la biosíntesis de folato fue aproximadamente ocho veces mayor que en el tipo silvestre, en el que no se observaba sobreexpresión de los genes heterólogos de folato. La concentración de folato inicial se mantuvo similar entre las otras cepas no recombinantes.
En segundo lugar se llevaron a cabo otros dos ensayo para determinar la influencia de la expresión de los genes de la biosíntesis de folato sobre la densidad celular y la producción de 2-KGA en K. vulgare.
 Uno de estos ensayos se llevó a cabo en un matraz de agitación, donde se estudió la producción a pH estable con un valor de 7 e inestable con rango de pH variados en 0.5. Los resultados obtenidos a pH estable con la introducción de genes para la síntesis de folato tuvieron un impacto positivo. El mutante recombinante K. vulgare Rif pMCS2PsdhfolBC creció un 18% mejor que los controles; por otra parte, su producción en 2-KGA era un 14% mayor que en la cepa silvestre y Rif. Sin un pH estable, la sobreexpresión de genes de la biosíntesis de folato era capaz de aumenta la densidad celular solo un 5%, en comparación con los controles de K. vulgare DSM4025 y sin una mejora significativa de 2-KGA, en comparación con los controles K. vulgare DSM4025 y del Rif.
El otro ensayo se llevó a cabo en un fermentador, también para determinar la influencia de la expresión de los genes de la biosíntesis de folato sobre la densidad celular y la producción de 2-KGA. En esta parte del ensayo se llevó a cabo un estudio para mantener un pH estable de 7, dados los buenos resultados obtenidos en el ensayo anterior. La tasa de crecimiento especifico máxima de K. vulgare recombinante Rif (pMCS2PsdhfolBC) era de aproximadamente un 80% mayor que en los controles. Además, la productividad de 2-KGA se ve reforzada un 35% en comparación con las cepas control. El tipo silvestre K. vulgare DSM4025 y su mutante K. vulgare Rif mostraron crecimientos y producción de 2-KGA similares que con los matraces de agitación.


Conclusiones

Las conclusiones que los autores sacan de su trabajo, basándose en trabajos publicados con anterioridad, fue que los derivados del ácido fólico  junto con valores más altos de folB, folKE y folP son esenciales para mejorar el crecimiento y la producción de 2-KGA. Además la expresión de los genes de la ruta de la síntesis de folato añadidos mediante los plásmidos recombinantes, que eran incompletos en K. vulgare, dio como resultado una mejora de nueve veces mayor de concentración de folato intracelular, y se probó como un avance factible para el aumento de la densidad celular y la producción de 2-KGA de K. vulgare. Así también  la introducción de genes de la biosíntesis de folato a través de la ingeniería genética fue útil para mejorar la producción de vitamina C, respecto a la adición directa de derivados de folato al medio de cultivo.
Para finalizar, los genes de la biosíntesis de folato introducidos en K. vulgare han mostrado una mayor densidad celular y producción de 2-KGA. Por primera vez con este estudio, K. vulgare demostró ser una cepa apropiada con facilidad de expresión de múltiples genes, vía que posteriormente ha abierto un área de manipulación para muchas aplicaciones.

Autores Originales:

Lei Caia, Mei-Qing Yuanb, Zheng-Jun Lic, Jin-Chun Chena, Guo-Qiang Chena,*
aDept Biological Sciences and Biotechnology, MOE Key Lab. Bioinformatics (& System Biology), Tsinghua University-Peking University Joint Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China
bInstitute of Forensic Sciences, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
cCollege of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

Enlaces a:


2 comentarios:

  1. El tono divulgativo dela introducción es correcto. Sin embargo lo perdéis en los apartados posteriores. Como he indicado en la corrección del anterior trabajo, no es recomendable seguir la estructura de un artículo científico (Introducción, M&M, resultados, conclusiones).

    No hay ningún enlace en el texto que permita profundizar o aclarar términos (por ejemplo: “electroporación” o “vitamina C” o “medio HJ”)

    Las figuras son bastante difíciles de comprender ya que carecen de una leyenda o pie defigura donde se expliquen los detalles.

    Tenéis fallos de nomenclatura científica. Cuando se habla de genes, los nombres van en minúscula y en cursiva (ej: folC). Cuando se habla de proteínas, los nombre van en letra normal y la primera en mayúscula (ej: FolC)

    Tenéis un fallo de formato bastante curioso. La última palabra de vuestro texto tiene dos tamaños de letra distintos

    La referencia bibliográfica está en formato incorrecto. Os recuerdo que se os dio un ejemplo en las prácticas de informática. Y no es “autores originales” sino “artículo original” o "bibliografía"

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  2. Por cierto, os falta poner el nombre de los componentes del grupo como autores de esta entrada

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