Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

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jueves, 29 de mayo de 2014

Investigación del efecto de diferentes factores extracelulares en la producción de lipasas por Yarrowia lipolytica



Introducción:

Este artículo muestra el estudio que han llevado a cabo sus investigadores para conocer el efecto de cambios en factores extracelulares como la fuente de carbono (oleato de metilo), el oxígeno disuelto y el pH, en biorreactores a gran escala para la producción de lipasa extracelular por Yarrowia lipolytica, una levadura. Las lipasas son enzimas que disgregan las grasas, muy usadas en la industria para la fabricación de detergentes o producción de biodiésel. Para ello, se han utilizado cepas de Y. lipolytica obtenidas mediante manipulación genética que poseen unido al gen LIP2, que codifica la enzima lipasa, con un gen testigo, el lacZ, que codifica la β-galactosidasa. A partir de la síntesis paralela de ambas enzimas, podemos estimar la expresión de LIP2 por la actividad de la β-galactosidasa (hidroliza un compuesto dando lugar a otro con color amarillo, a más color amarillo, más expresión de ambos genes).
Se han utilizado biorreactores de pequeña escala clásicos y otros dos diseñados para reproducir lo que ocurre en los biorreactores a gran escala (el aumento de la escala implica imperfecciones en la mezcla). Todos ellos tienen capacidad de 20 L (con un volumen de trabajo de 12 L), y dos turbinas rushton para la agitación del medio.

http://www.ufz.de/export/data/1/27711_hefen.jpg
Yarrowia lipolytica. Origen de la imagen incrustada

Experimento:

Efecto de la disponibilidad del oleato de metilo y el oxígeno disuelto.
Se estudió el efecto de la disponibilidad del oleato de metilo para la producción de lipasa cultivando a Y. lipolityca en dos biorreactores distintos, uno clásico y un P-SDR, que presenta dos secciones (una parte mezclada y otra no mezclada). El tiempo de residencia en la parte no mezclada varía según el flujo de recircularización de la bomba. En la parte mezclada, las turbinas rushton aseguran una dispersión eficiente del oleato de metilo, pero en la parte no mezclada, se produce una caída en el nivel de la eficiencia de su dispersión, siendo perjudicial para la producción de lipasa. La disminución de la eficiencia de transferencia de oxígeno en la parte no-mezclada limita el crecimiento óptimo de las células y, por lo tanto, la producción de lipasa, por lo que se elabora otro diseño de reactor para medir las fluctuaciones de oxígeno.



P-SDR (Partitioned Scale-Down Reactor)

Aquí se observa que en la parte mixta  las turbinas rushton aseguran una dispersión eficiente del oleato de metilo pero ocurre una caída en el nivel de la eficiencia en la parte no mixta, como también se produce una disminución en la eficiencia de la transferencia de oxígeno. Imagen original.

Efecto de las fluctuaciones del nivel de oxígeno disuelto.
Se cultiva a Y. lipolytica en un biorreactor clásico y en dos C-SDR, en los cuales el flujo de aire se cierra y se abre de forma alterna por una válvula eléctrica controlada por un algoritmo específico de dos formas distintas. El primer algoritmo de control consiste en ciclos regulares de on/off donde la duración del tiempo de encendido y apagado se basan en el tiempo de residencia en la parte mezclada y no mezclada, mientras que el segundo algoritmo de control crea ciclos aleatorios de on/off. Los dos C-SDR muestran una caída significativa del nivel de producción de lipasa extracelular, más pronunciada en el caso del C-SDR con un esquema de on/off regular, donde el estrés inducido por las fluctuaciones de oxígeno disuelto es mayor. Este estrés tiene un gran impacto en el nivel de expresión de LIP2, disminuyendo el rendimiento de lipasa extracelular.


C-SDR (Controlled Scale-Down Reactor)


En los C-SDR se observa una caída significativa del nivel de producción de lipasa extracelular, más pronunciada en el caso del C-SDR con un esquema de on/off regular: las fluctuaciones de oxígeno provocan un estrés y genera un impacto en el nivel de expresión de LIP2 (Imagen original)

Efecto de las variaciones de pH locales.
Para observar el efecto de las variciones de pH se cultiva, en este caso, a Y. lipolytica en cuatro biorreactores P-SDR: dos de ellos con una regulación normal del pH, alrededor de 7, (donde el gradiente es rápidamente atenuado por la eficiencia de mezcla) y dos con una regulación en la parte no mezclada, ambos a tiempos de residencia de 2,5 y 5 min. El pH está normalmente regulado mediante la adición de base o ácido por la parte superior del reactor y la medición de pH con una sonda situada en la parte inferior del reactor, mientras que las fluctuaciones de pH se producen con la adición de  KOH o H3PO4 en la parte no mezclada del P-SDR. El rendimiento de lipasa extracelular es ligeramente inferior para el P-SDR con regulación de pH realizado en el nivel de la parte no mezclada (algo más pronunciado en el caso del tiempo de residencia de 2,5 min). Los ensayos de β-galactosidasa muestran una caída en el nivel de la expresión del gen LIP2. En general, no se percibe efecto adicional cuando creamos fluctuaciones en los  gradientes de pH. Sin embargo, observamos una modificación morfológica de las células: las células de Y. lipolytica aparecen con una morfología filamentosa.


P-SDR con gradiente de pH controlado



Finalmente, se observa que no afecta de manera tan decisiva en el crecimiento celular cuando se le añaden fluctuaciones de pH, pero en cambio, sí se puede observar una mayor caída en el nivel de expresión de LIP2 (Imagen original)

Conclusión y resultados:

El efecto de los factores ambientales en la producción de lipasa por Y. lipolytica se ha observado en dos niveles fisiológicos distintos: en condiciones de estrés leves, donde se observa impacto a nivel de la producción de biomasa y la tasa específica de la producción de lipasa; y en condiciones de estrés severo, las cuales tienen efecto directamente en el nivel de la expresión del gen LIP2, lo cual se observa, sobre todo,  en el C-SDR que produce fluctuaciones en el nivel de oxígeno disuelto. Los efectos de la dispersión de oleato de metilo y el gradiente de pH solo se observan en una reducción en el crecimiento de la biomasa y la producción de lipasa, a excepción del gradiente de pH llevado a cabo con un TR de 2,5 min, en el que se observa un ligero efecto sobre la expresión del gen LIP2. Se van a llevar a cabo más estudios para una mejor caracterización de la intensidad y la frecuencia de estos dos factores ambientales en paralelo con la caracterización en los biorreactores de escala industrial.




Investigation of the effect of different extracellular factors on the lipase production by Yarrowia lipolityca on the basis of a scale-down approach
September 2008, Volume 35, Issue 9, pp 1053-1059 

            Trabajo realizado por: Guillem Vicente Ortiz, Antonio Daniel Molina Martínez, Eva Núñez Delegido, Sofía Martínez López y Ceylan Mutlu


2 comentarios:

  1. El tono divulgativo es correcto en la introducción y el uso de enlaces para ampliar los conceptos es perfectamente adecuado. Sin embargo, ese tono lo perdéis cuando llegáis a la descripción de los experimentos y conseguís que el contenido sólo pueda ser comprendido por especialistas . Otro gran problema que le veo es que os faltan imágenes que expliquen esos experimentos y/o resultados. También os faltan enlaces que permitan ampliar o aclarar los conceptos que se manejan (un lector puede preguntarse qué es un “biorreactor P-SDR”).

    Os digo lo mismo que a otros de vuestros compañeros: en un artículo divulgativo no es conveniente usar la misma estructura que la de un artículo científico.

    Hay un pequeño error de nomenclatura. En bacterias es el gen lacZ (en cursivas y minúscula), si ponéis LacZ estáis hablando de la proteína. En levaduras la nomenclatura es distinta y por eso se usan mayúculas para las abreviaturas

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    1. Hemos corregido los fallos, mejorado el formato y añadido figuras y explicaciones que esperamos aumenten el grado de divulgación y comprensión del trabajo.
      Un saludo!

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