Ingeniería genética en Escherichia coli para mejorar la producción de etanol a partir de gluconato

Actualmente se está experimentando una creciente demanda energética. La utilización de combustibles fósiles para suplir las necesidades energéticas conlleva una serie de consecuencias perjudiciales; como puede ser el incremento de CO₂ emitido a la atmósfera (resultado de la combustión de dichos combustibles) o la lluvia ácida. Es por ello que la utilización de biocombustibles como el etanol resulta una fuente de energía alternativa que es cada vez más prometedora. Concretamente, la biomasa celulósica presenta un bajo coste de producción y es muy abundante. A partir de la hidrólisis de la biomasa celulósica se obtienen tanto hexosas como pentosas, entre otros azúcares, que pueden ser transformados en biocombustibles como el etanol, mediante la actuación de microorganismos fermentadores.

Aunque existen microorganismos etanogénicos, estos se ven limitados por su capacidad para utilizar pentosas como sustratos (constituyendo estas el 90% del total de biomasa celulósica). Es decir, son homoproductoras de etanol (no producen ningún otro producto final), pero son incapaces de utilizar la fuente de monómeros más importante en la biomasa celulósica; las pentosas.

Por otro lado, Escherichia coli, aunque carece de la capacidad para producir etanol como único producto final, sí presenta la habilidad de utilizar diversos tipos de azúcares como sustrato, obteniendo rendimientos mayores de la biomasa celulósica. Además, es capaz de asimilar con mayor velocidad el gluconato, presente en la biomasa celulósica.

 ESCHERICHIA COLI Y METABOLISMO

Con el objetivo aprovechar las ventajas que presenta Escherichia coli, el estudio se centra en el metabolismo de esta bacteria anerobia facultativa. Éste se puede dividir en dos fases principales; la degradación de los carbohidratos para obtener piruvato y la degradación de éste (diferente en condiciones aeróbicas y anaeróbicas).

Las diferencias que supone la utilización del gluconato como fuente de carbono alternativa a la glucosa derivan de su  producción energética en la via de Entner-Doudoroff, convirtiéndose en piruvato (menor producción energética con respecto a la glucólisis).  En condiciones anaeróbicas se producen 2 moles de ATP y dos de NADH por mol de glucosa para dar piruvato; mientras que con gluconato solo se obtiene 1 mol de ATP y 1 mol de NADH. Para compensar esta diferencia (pérdida) de ATP, las bacterias sintetizan más productos oxidados como el acetato (que rinde ATP y NADH), produciendo lactato y etanol, con el objetivo de controlar la concentración de NADH.

Una vez obtenido el piruvato, este puede degradarse a través de cuatro rutas distintas, resumidas en el siguiente esquema:

Vías metabólicas por las que puede degradarse el piruvato (fermentaciones)

Durante el estudio realizado por los investigadores, se aprovecha la capacidad de E. coli para metabolizar diferentes productos, realizando una serie de experimentos para determinar cómo es posible incrementar el rendimiento en la producción de etanol (y disminuir la de acetato y lactato).

MATERIALES Y MÉTODOS

Para los distintos experimentos se trabajó con la cepa E. coli K011, construida mediante la integración de la ruta de producción de etanol de Zymmonas mobilis (operón PET). E. coli K011 fue transformada para llevar a cabo los experimentos en diferentes cepas que se han obtenido a partir de esta. Para la obtención de dichas cepas se han noqueado distintos genes (codifican enzimas que participan en las rutas metabólicas fermentativas) por recombinación homóloga en diferentes combinaciones de estos genes noqueados. De este modo, se pudo estudiar qué efectos producen los genes modificados en el metabolismo de la bacteria: crecimiento, productos y rendimiento. 

En los experimentos, el medio de cultivo sobre el que se ha llevado a cabo las fermentaciones contiene medio LB (Luria Bertani) y 2 % de glucosa, además del sustrato (glucosa o gluconato). El pH fue ajustado a 6.5 y se consiguieron condiciones anaerobias. Las muestras fueron extraídas a distintos intervalos de tiempo para determinar la concentración de los metabolitos y la masa celular.

RESULTADOS

- Crecimiento:

Velocidad de crecimiento máxima de E. coli K001 y las estirpes mutantes con glucosa o gluconato

Cuando la glucosa es utilizada como fuente de carbono, todas las cepas son capaces de producir la fermentación de dicho compuesto, dando lugar a etanol como producto principal (más de un 100% del máximo teórico es alcanzado). Sin embargo, E. coli K011 produce una pequeña cantidad de acetato.

Utilizando gluconato como sustrato se pueden observar tendencias similares en los mutantes a cuando se utiliza glucosa, aunque se aprecia que todas las cepas que se estudiaron utilizaban el gluconato con mayor rapidez que la glucosa, alcanzando velocidades de crecimiento mayores. El rendimiento de producción de etanol en E. coli K011 es de un 87.5% comparado con el rendimiento teórico (sin embargo, el rendimiento de acetato aumentó hasta 117%).

- Producción de etanol:

 El consumo de piruvato se encuentra desviado hacia la producción de acetil-coA. La enzima PDH es inhibida por NADH en condiciones anaerobias, pero la enzima LDH no requiere NADH para su funcionamiento. Por lo tanto, las dos vías catalizadas por estas enzimas están reguladas por NADH y evitarán la competición entre ellas. Sin embargo, la actividad de PDH no es nula en condiciones anaerobias: funciona para mantener el equilibrio entre NADH y NAD+.

Cuando se usa glucosa, el ratio NADH/NAD+ es mayor porque la glucosa es un sustrato más reducido. Esto causa que PDH quede inhibida y la producción de etanol aumente por la presencia de NADH.

Al utilizar gluconato como sustrato, la producción de acetato en general aumenta, ya que se utiliza esta vía para compensar la pérdida de ATP con respecto a la utilización de glucosa como sustrato. Además, se debe mantener un equilibrio entre NADH y NAD+, consumiéndose el exceso de NADH gracias a la formación de lactato y etanol.

Teniendo estos dos factores en cuenta, la estrategia utilizada para mejorar la producción de etanol en E. coli K011 consiste en el noqueo de los genes pflA y ldh en conjunto. El noqueo de pflA hace que solo se pueda producir acetato y ATP a la vez que NADH a través de la ruta catalizada por PDH. El exceso de NADH producido por esta vía solo puede compensarse con la producción de etanol, ya que el gen ldh también está noqueado. Por lo tanto, esta combinación es la óptima si se desea mejorar el rendimiento en la producción de etanol.

CONCLUSIÓN

Aunque la eliminación de rutas metabólicas competentes no produzca una mejora muy notable de la producción de etanol cuando se utiliza glucosa como sustrato, sí que se aprecian diferencias importantes utilizando gluconato.

En el experimento se consiguió aumentar el rendimiento de la producción de etanol a partir de gluconato gracias a al noqueo de pfl y ldh en conjunto. Sin embargo, el noqueo de estos genes afectan moderadamente a la velocidad de crecimiento de las bacterias, disminuyendo esta velocidad a un 70% de su valor en la cepa silvestre (E. coli K011).

ARTÍCULO ORGINAL

Amanda Hildebrand, Theresa Schlacta, Rebeccah Warmack,Takao Kasugab Zhiliang Fan, "Engineering Escherichia coli for improved ethanol production from gluconate", Journal of Biotechnology, 168 (2013) 101– 106.

*Las dos primeras imágenes han sido tomadas del artículo original


TRABAJO REALIZADO POR: 
Samuel Daniel Lup, Esther Marhuenda Segarra, Adrián Martínez Tébar, Elisa Pérez Galiano y Marta Rubio Camacho