Stimulating soil microorganisms for mineralizing the herbicide isoproturon by means of microbial electroremediating cells

La principal actividad para la eliminación de contaminantes en el medio ambiente es la biodegradación, donde se utiliza el metabolismo de microorganismos para degradar dichos componentes (se puede comprobar haciendo click aquí). Estos procesos dependen de diferentes factores como: los propios microorganismos o el número de aceptores de electrones terminales (TEA), es decir, sustancias que reciben los electrones procedentes de las reacciones químicas. La falta de estos aceptores hace que los contaminantes desaparezcan más lentamente en ciertas condiciones.

La hipótesis y lo que se ha propuesto en este artículo ha sido la utilización de una serie de electrodos (sólidos conductores aceptores de electrones, MERCs) para mejorar la biodegradación de los contaminantes respecto a la forma clásica, la cual consiste solamente en desplazar los residuos.

El objetivo del trabajo fue probar que al utilizar electrodos en potenciales positivos se favorece la degradación de sustancias nocivas acumuladas en el suelo.

Figura 1: modelo de las células en las que
se ha llevado a cabo el experimento

Para ello se han llevado a cabo una serie de experimentos en los que se midió la degradación de un compuesto contaminante en el suelo. El residuo de interés empleado fue un herbicida llamado isoproturon (IPU), marcado con carbono radiactivo (que nos permite observar su degradación). Para poder realizar el estudio se prepararon una serie de muestras de suelo que no contenían ninguna traza de este herbicida. A continuación estas muestras fueron contaminadas de forma controlada con unas cantidades determinadas de IPU. Finalmente, las muestras se sometieron a una serie de condiciones (distintos potenciales en los electrodos y medio inundado sin oxígeno) tras las que se registró la degradación del contaminante. El experimento se realizó en un sistema como el que se muestra en la Figura 1.  

En la siguiente gráfica (Figura 2) se representan los resultados de los primeros 25 días del experimento. Tal y como representa la línea de puntos triangulares, la degradación del agente contaminante en presencia de electrodos con potencial positivo es  unas 20 veces superior respecto a la dada en condiciones normales, representada por la línea de puntos cuadrados.  

Figura 2: degradación del agente contaminante
en función del tiempo y de la presencia de electrodos
con un potencial positivo (pol-MERC) o sin estos
electrodos (control)

Sin embargo, tras 25 días, el sistema perdió funcionalidad debido a la saturación de los electrodos (se generan especies negativas que se adhieren a los electrodos positivos). Por esta razón, se realizó un experimento a más largo plazo en el que se llevó a cabo la inversión del potencial (600 mV a -300 mV) de los electrodos, con el objetivo de liberar las especies que impedían el correcto funcionamiento del sistema. Los resultados de este experimento a largo plazo se indican en la Figura 3.

Figura 3: tasa de mineralización frente al tiempo.
En el día 25 se observa un pico que hace referencia
a la inversión del potencial de electrodos

Tras el análisis de los resultados identificamos un descenso en el crecimiento de la mineralización acumulativa, así como un decaimiento de la tasa de mineralización: de estos resultados concluimos que el potencial ha de ser positivo para que se produzca la degradación de la sustancia nociva.

A su vez, es necesario destacar las perspectivas de futuro de esta técnica. Como ya se ha comentado, la degradación de los contaminantes puede ser llevada a cabo por microorganismos de la zona si se encuentran en condiciones adecuadas. En cambio, si estas condiciones no son favorables, se estudia el uso de técnicas como la electrorremediación que mejora considerablemente el metabolismo de los microorganismos que se encargan de eliminar los contaminantes del medio (biorremediación). En un futuro, pueden ser eficaces para procesos de descontaminación de suelos agrícolas. Sin embargo, su uso no se limita a suelos agrícolas, sino que también se está convirtiendo en una técnica ampliamente usada para la limpieza del medio ambiente, con aplicaciones paliativas muy eficaces frente a catástrofes ecológicas. Es importante el desarrollo de estas técnicas tanto para el medio ambiente como para la agricultura, ya que una inversión en técnicas de este tipo supondría un ahorro a largo plazo puesto que la tierra empleada para un cultivo anterior en el que se ha echado fertilizante, por ejemplo, se puede reutilizar con mayor eficacia, minimizando la contaminación causada por pesticidas y aumentando la productividad de las cosechas.

Referencias bibliográficas

• Rodrigo Quejigo et. al (2016) Stimulating soil microorganisms for mineralizing the herbicide isoproturon by means of microbial electroremediating cells. Microb Biotechnol, 9(3): 369–380  [PubMed]
• http://www.miliarium.com/Prontuario/TratamientoSuelos/Bioventing.asp
• http://www.argenbio.org/index.php?action=novedades&note=202
• http://www.cienciaydesarrollo.mx/?p=articulo&id=71

CULTIVATION OF OLEAGINOUS RHODOTORULA MUCILAGINOSA IN AIRLIFT BIOREACTOR

BY USING SEAWATER

Hong-Wei Yen, Yu-Ting Liao, and Yi Xian Liu

El artículo se basa en el estudio del microorganismo Rhodotorula mucilaginosa  (antiguamente llamado Rhodotorula rubra) y la manera de cultivarlo para su uso en la producción de biocombustibles. Además de ser una especie de levadura unicelular pigmentada, es un microorganismo aerobio estricto. Se caracteriza por formar colonias de color anaranjado/rojizo cuando crece en SDA (Agar Sabouraud Dextrosa).

Rhodotorula Mucilaginosa

Este microorganismo tiene gran interés en la microbiología industrial porque puede usarse para la producción de biocombustibles, ya que presenta un rápido crecimiento, es capaz de almacenar una gran cantidad de lípidos y puede consumir más de una fuente de carbono.

A continuación, se adjunta el enlace a un vídeo donde se explican otras de las características de dicho microorganismo:

https://www.youtube.com/watch?v=Op3ruYeUqLo  

La hipótesis se basa en que el microorganismo puede almacenar diferentes cantidades de lípidos en función de las condiciones de crecimiento, obteniéndose una mayor cantidad cuando se cultiva en fed-batch.

R. mucilaginosa puede tolerar grandes cantidades de NaCl (sal) hasta el 7%, aunque algunas de sus actividades biológicas se ven reducidas. La hipótesis señala que la acumulación de glicerol intracelular bajo condiciones osmóticas severas ejerce un papel crucial en la osmorregulación.

El propósito de emplear esta levadura es conseguir una materia prima más económica para hacer biocombustibles. Con el objetivo de disminuir el gran consumo de recursos hídricos y el precio del proceso de fermentación llevado a cabo por este microorganismo, se utiliza agua de mar en lugar de agua pura.

En el artículo  se efectúan tres experimentos, de los cuales se van a desarrollar con mayor detalle el primero y el último:

• El primero de ellos registra el crecimiento de R. mucilaginosa a distintas concentraciones de NaCl.

• El segundo estudia el efecto de la combinación de agua de mar y agua pura, en diferentes proporciones, en el crecimiento del microorganismo.
• El tercer experimento comenta los efectos del agua de mar en el crecimiento de R. mucilaginosa en un biorreactor de ascenso de aire de 5 litros.

Cabe añadir que dichas fermentaciones se han llevado a cabo en un biorreactor de ascenso de aire sin dispositivo de agitación, utilizando R. mucilaginosa congelada en seco en medio de cultivo con glicerol y agua de mar. Además, la cepa empleada fue mutada con NTG para aumentar la acumulación lipídica.

En el primer experimento que trata el artículo se analiza el efecto de las distintas concentraciones de NaCl en diferentes agitaciones. El objetivo de este experimento consiste en conocer la viabilidad del crecimiento de R. mucilaginosa con agua de mar. Para ello, los cultivos fueron examinados en matraces de agitación utilizando 60 g/l de glicerol en bruto como fuente de carbono. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente gráfica:

Dicha figura indica cómo un aumento progresivo de la concentración de NaCl produce una disminución de la biomasa, del crecimiento celular, del contenido lipídico y de β-caroteno. Sin embargo, en un estudio anterior realizado con Rhodotorula glutinis, se demostró que un aumento de la presión osmótica produce un incremento en el contenido lipídico y un decremento en el de polisacáridos. No obstante, la composición cualitativa de los lípidos intracelulares no varía.

A pesar de no conocer las razones por las cuales Rhodotorula sobrevive a altas concentraciones salinas, se estima que podría haber una relación entre la salinidad del medio y la concentración intracelular de glicerol, siendo éste el responsable de equilibrar la presión osmótica del medio intracelular con respecto al medio salino.

Aunque no se conoce la concentración interna de glicerol, los resultados obtenidos por Zheng y sus colaboradores demostraron que R. mucilaginosa puede tolerar altas concentraciones salinas sin conllevar a un cambio en el contenido lipídico.

Otro de los experimentos que se estudia en el artículo es el efecto de las diferentes proporciones de agua de mar y de agua pura en el crecimiento de R. mucilaginosa.

En la figura siguiente, si se compara la cantidad de biomasa obtenida, se observa un menor crecimiento cuando se emplea un porcentaje muy alto de agua de mar. Podemos concluir que ésta es una disminución significativa en la cantidad de biomasa. Sin embargo, en cuanto al contenido lipídico, los efectos derivados de añadir agua de mar no son claros, pues la cantidad lipídica obtenida es similar tras realizar los diferentes experimentos en los que variamos las proporciones de agua pura y agua de mar. De este hecho se deduce que, aunque una alta presión osmótica en el cultivo en batch con agua de mar puede disminuir el crecimiento celular, no altera la acumulación lipídica de R. mucilaginosa.

El tercer experimento que se explica en el artículo son los efectos del agua de mar en el crecimiento de R. mucilaginosa en un biorreactor de ascenso de aire.

Los resultados obtenidos en éste demuestran que usando agua de mar en lugar de agua pura, el crecimiento de R. mucilaginosa disminuye. Sin embargo, el agua de mar es una opción más atractiva debido al bajo coste y al uso limitado del agua. En la siguiente gráfica se muestra una comparación entre el uso de agua de mar y el uso de agua pura y, en la tabla, los datos cinéticos relacionados:

En esta tabla, podemos observar que la velocidad de crecimiento de biomasa es mayor en el cultivo en batch con agua pura que con agua de mar. No obstante, la cantidad máxima de biomasa obtenida es similar en ambos cultivos. Además, una velocidad de crecimiento más lenta, nos indica un retraso en el crecimiento celular por la alta presión osmótica. Debido a este retraso, la cantidad máxima de biomasa tardará más tiempo en ser alcanzada. Por otra parte, el alargamiento de la fase de crecimiento conduce a una acumulación mayor de lípidos en las células cultivadas en batch con agua de mar.

A pesar de estos inconvenientes, las razones por las que R. mucilaginosa sobrevive no son claras. Sin embargo, la síntesis de glicerol intracelular ha de ser un factor relevante en la osmorregulación de la levadura. A continuación, se muestra cómo oscilan las diferentes variables en función del tiempo cuando se cultiva R. mucilaginosa en un cultivo en batch con agua de mar:

En esta figura se observa la disminución simultánea de la osmolaridad y salinidad conforme transcurre el tiempo de cultivo. Esto sugiere que este microorganismo podría utilizar directamente el NaCl para reducir la salinidad del medio, además de los efectos osmorreguladores de la formación de glicerol intracelular.

En esta tabla podemos observar diversos cambios en la concentración de los diferentes ácidos grasos de la especie R. mucilaginosa, la cual ha sido cultivada en dos medios distintos: uno de agua pura y otro de agua de mar. Los resultados demuestran que tanto el uso de agua de mar como de pura no modifican significativamente el contenido lipídico. De esta forma, podemos concluir que el uso de agua de mar es apropiado para la acumulación total de lípidos en la levadura.

En definitiva, la concentración salina aplicada genera una disminución en el crecimiento del microorganismo. Al mismo tiempo, se ha demostrado que existe una correlación entre el aumento de la concentración de NaCl y el aumento de glicerol intracelular. Esto es así porque este lípido juega un papel crucial en la osmorregulación. Por otra parte, variando las proporciones de agua de mar y agua pura se observó que no cambiaba el rango de lípidos intracelulares, solamente el tiempo que tardaban las células en conseguirlos.

El objetivo final de este experimento es obtener una materia prima para la producción de biocombustibles, tales como el biodiesel o el bioetanol.

Experimentos similares a los narrados en este artículo ya se han llevado a cabo empleando algas, concretamente especies unicelulares y cianobacterias. El principio en el cual se basa es el mismo que el ya descrito: la acumulación de aceites intracelulares, los cuales se pueden transformar en biocombustibles. El experimento con el microorganismo narrado podría aumentar la eficiencia del proceso y abaratar costes, ya que se conoce perfectamente la ingeniería necesaria para crecer levaduras industrialmente y podría además solventar algunos de los problemas que surgen en cuanto al crecimiento de algas, como el auto-oscurecimiento o la necesidad de añadir elementos como el fósforo al medio de cultivo.

También podría plantearse la creación de un biocombustible de tercera generación combinando ambos organismos mediante ingeniería genética.

Dichos combustibles son una alternativa para reducir la contaminación y la emisión de gases de efecto invernadero producidos por los combustibles fósiles. Además, suponen una fuente de energía alternativa frente a dichos combustibles y ayudan a la creación de empleo, dado que algunos de ellos requieren de materias primas que se tienen que cultivar.

A continuación se muestra un vídeo en el que se explica un poco más acerca de estos biocombustibles y cómo nos ayudarán en un futuro:

https://www.youtube.com/watch?v=zrui4tnH-Cc

Bibliografía:

Hong-Wei Yen, Yu-Ting Liao, and Yi Xian Liu
Cultivation of oleaginous Rhodotorula mucilaginosa in airlift bioreactor by using seawater
Journal of Bioscience and Bioengineering. VOL. 121 No.2, 209-212, 2016.

Grupo compuesto por: Valeria Navarro Pérez, Laura García Abad, Gema Puebla Planas, Laura Brazales Esquitino y Marina García Bejarano.

Levaduras y producción de nanopartículas.

          La nanotecnología es una ciencia que engloba muchos aspectos de diversas ramas del conocimiento (física, química, biología, etc.). Tiene como objetivo principal el estudio y la síntesis de nanopartículas. Éstas no son más que versiones de los distintos materiales que se utilizan diariamente en muchas industrias e incluso en la vida cotidiana, pero caracterizados por tener tamaños de 1 a 100 nm (1 millón de veces más pequeños que un milímetro). Además poseen propiedades únicas que las diferencian de las que poseen sus análogos a gran escala. Estas propiedades eléctricas, químicas, ópticas, físicas, etc. han hecho que estos materiales sean de vital importancia en diferentes campos como la industria en general, la electrónica, la óptica, e incluso la agricultura, el medio ambiente y la medicina.

En los orígenes de esta ciencia (no hace más de 50 años) se centraban en métodos físico-químicos de síntesis de estos nanomateriales. Actualmente, las investigaciones se centran en la utilidad y aplicaciones de estos compuestos, encontrándose con el inconveniente de que los subproductos del proceso de síntesis clásica dan lugar problemas medioambientales por su toxicidad, limitando mucho sus usos. Sobre todo los clínicos. En este sentido, los investigadores se han visto impulsados a buscar nuevas vías de síntesis más respetuosas con el medio ambiente y que sean económicamente factibles, encontrando en el uso de microorganismos (bacterias, hongos y levaduras) una solución casi perfecta. La síntesis biológica no produce residuos de alta toxicidad y su escalado a nivel industrial podría ser, no solo económicamente factible, sino que muy beneficioso “matando así dos pájaros de un tiro” (1).

A. Distintas nanopartículas B. Uso de nanopartículas como sondas para cancer (2)

Tras años de investigación se pueden encontrar diversos microorganismos que se encargan de la síntesis de nanopartículas inorgánicas como por ejemplo de plata, de oro, de sulfuro de plomo (PbS), etc. Entre todos estos podríamos destacar el sulfuro de cinc (ZnS), cuyas nanopartículas son ampliamente utilizadas en sensores de diversos tipos: glucómetros para diabéticos, pHmetros de laboratorio (que miden la acidez), sensores de radiación UV, etc (3). Esto se debe a que en escalas muy pequeñas, el sulfuro de cinc adquiere propiedades luminiscentes y eléctricas muy particulares que le permiten, usado correctamente, emitir luz o electricidad de manera muy sensible y eficaz en presencia un estímulo. Éste dependerá de para qué y cómo esté diseñado el sensor. Un ejemplo de ello es detectar específicamente la localización de células cancerosas. Cuando  la nanopartícula detecta una célula cancerosa, se une a ella y “emite luz”.

Esta capacidad de emitir luz es la que los hace extraordinariamente atractivos en medicina. Pueden hacerlo gracias a un proceso llamado confinamiento cuántico. Podríamos decir que es un análogo mejorado de la fluorescencia. Ésta consiste en que al darle energía a compuestos especiales, éstos la devuelven inmediatamente después aunque algo disminuida gracias a su estructura química. Un ejemplo de ello sería la quinina presente en el agua de tónica. Si esa forma de energía es la luz, la partícula emitirá luz que a pesar de tener menor energía que la suministrada, seguimos siendo capaces de detectarla.

Las partículas de pequeño tamaño, como las nanopartículas, tienen la peculiaridad de que las pérdidas de la energía suministrada son muy pequeñas y la emisión en forma de luz mucho mayor y muy fácil de detectar. A ésto es a lo que se le llama confinamiento cuántico y por ello se las denomina quantum dots. Además, como podemos ver en la imagen inferior, el color de la emisión depende del tamaño de la nanopartícula. Como veíamos en el ejemplo del ratón, es particularmente interesante esta cualidad, no solo para detectar fácilmente la emisión si no para poder detectar distintos estímulos, por ejemplo, distintos tipos celulares.

A. Mecanismo de emisión de los quantum dot B. Distintas emisiones en función del tamaño

Debido al gran interés que tiene la producción de esta nanopartícula, se ha estudiado su  síntesis en bacterias de diversos tipos. Sin embargo, poco se había estudiado de su producción por levaduras. En este sentido y conociendo la versatilidad de estos microorganismos en procesos industriales, investigadores del Central Leather Research Institute de India, han estudiado si Saccharomyces cerevisiae (la levadura del pan, la cerveza y el vino) es capaz de producir nanopartículas de sulfuro de cinc.

Lo primero que se hizo fue averiguar si la levadura era capaz de sobrevivir a la exposición a la materia prima. Para que se produzca nuestro nanomaterial, hay que suministrarle a las células una fuente de azufre y de cinc (queremos ZnS) y estas fuentes pueden afectar el crecimiento del microorganismo. En este caso, se utilizó sulfato de cinc (ZnSO₄), un suplemento común en alimentación animal y abonos. Se puso en el medio de crecimiento de las células y se observó si había crecimiento y si éste era correcto.

A. Imagen de Microscopio electrónico de Saccharomyces cerevisiae  B. Placa de cultivo de este microorganismo (1) C. Perfil de crecimiento de S. cerevisiae en presencia de materia prima (1)

En la imagen superior se observa a la izquierda una imagen de microscopía electrónica de células de la levadura. En el centro, una placa cultivo en la que ésta crece y a la derecha una representación las medidas realizadas del crecimiento, dónde la línea representa el número aproximado de células en el cultivo. En esta gráfica podemos ver que a medida que pasa el tiempo, el número de células aumenta a pesar de que el medio contenga el sulfato de cinc por lo que las células pueden vivir sin problemas y se puede pasar a investigar la producción de nanopartículas.

Con el fin de optimizar el proceso, los investigadores intentan averiguar las condiciones óptimas de crecimiento. Prueban distintas concentraciones de sustrato y de inóculo (las células que se añadirán al medio para que produzcan las nanopartículas) y tras encontrar las mejores se procede a la síntesis del producto. Tras cultivar a las células en un medio con materia prima, se monitoriza la presencia de las partículas utilizando como señal las propias propiedades ópticas de éstas. Se observa además, que tras un día de cultivo se produce el máximo de producto (como se ve en la imagen inferior a la izquierda) y que éste se encuentra en el interior de las levaduras. A las 24 horas se procede a extraer las partículas utilizando quizás uno de los métodos más sencillos de extracción. Se congelan las células a bajas temperaturas, los cristales de hielo rompen las estructuras celulares provocando que cuando se descongelan bruscamente se libere el contenido. Después, como si de una lavadora se tratara, se centrifuga, obteniendo una disolución con las partículas y descartándose los restos celulares.

Una vez obtenido el producto se procede a caracterizar sus propiedades, es decir, se quiere saber si poseen las características que las hacen tan útiles, ya que al ser producidas por un microorganismo, no se sabe si las conservan todas. Mediante técnicas de microscopía se observa la forma de las nanopartículas (imagen de la derecha). En negro se observan esferitas de distintos tamaños (30-40 nm), todas ellas como dijimos casi un millón de veces más pequeñas que un milímetro. Ésto confirma que al menos tienen el tamaño deseado. Mediante otras técnicas más avanzadas como análisis del espectro de ultravioleta, fotoluminiscencia y difracción de rayos X en polvo, se puede comprobar si la estructura interna de las partículas es la adecuada, así como su capacidad de emitir luz o sus propiedades eléctricas.

A. Perfil de producción de nanopartículas (1) B. Mecanismo de extracción C. Nanopartículas de ZnS al Microscopio electrónico de transmisión (1).

El análisis de los resultados demostró que todas las partículas mostraban las propiedades ópticas, eléctricas y luminiscentes que se buscaban. Ésto confirma por tanto, la hipótesis de los investigadores. La levadura puede sintetizar sin problemas el producto de interés apuntando además como modelo idóneo de síntesis por sus buenas cualidades como "trabajador industrial". Por otro lado, en comparación con otros microorganismos estudiados, las levaduras tienen una mayor capacidad de síntesis de nanopartículas de ZnS, probablemente debido a que su volumen celular es bastante mayor (el doble o triple que algunas bacterias) y que las reacciones que provocan la síntesis de las partículas son más potentes. Sin embargo, poco se sabe acerca de estas reacciones que ocurren en el interior de la célula por lo que se requiere más investigación sobre el tema. Cuando esta información se sepa, podríamos “enseñarle” a las levaduras cómo sintetizar más y mejores nanopartículas de ZnS, y quién sabe, quizás montar una empresa para su producción industrial.

BIBLIOGRAFÍA

1. Facile production of ZnS quantum dot nanoparticles by Saccharomyces cerevisiae MTCC 2918. Sandana Mala J, Rose C. J Biotechnol. 2014 Jan 20;170:73-8. doi: 10.1016/j.jbiotec.2013.11.017. Epub 2013 Dec 6.
2. ZnS nanostructures: From synthesis to applications. Xiaosheng Fang, Tianyou Zhai, Ujjal K. Gautam, Liang Li, Limin Wua, Yoshio Bando, Dmitri Golberg. Progress in Materials Science 56 (2011) 175–287 doi:10.1016/j.pmatsci.2010.10.001
3. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Xiaohu Gao, Yuanyuan Cui, Richard M Levenson, Leland W K Chung, Shuming Nie. Nat Biotechnol. 2004 Aug;22(8):969-76. Epub 2004 Jul 18.

TRABAJO REALIZADO POR: Clara Manzanaro Cifuentes, Sebastián Martínez López, Alba Pérez Martínez,Carla Romero Sansano, Erundina Ruiz Pérez,