Streptomyces bingchenggensis es una bacteria gram positiva de la clase
actinobacterias, perteneciente al género Streptomyces, responsable de
procesos fermentativos de materia orgánica y de la producción de milbemicinas,
antibióticos macrólidos (destacados en el tratamiento de infecciones causadas
por bacterias intracelulares) de 16 miembros con una actividad excepcional
contra diversos tipos de ácaros. Los tipos conocidos de milbemicinas son alfa1 (A3),
alfa3 (A4), beta14, beta28, beta29, alfa30 y ST 906, cuatro secomilbemicinas A, B,
C y D, y dos milbemicinas pentapeptídicas. Para la elevada producción de los
productos A3 y A4 se obtuvo una estirpe mutante
fenotípicamente diferente a Streptomyces bingchenggensis, denominada S.
bingchenggensis X-4, mediante procesos de tratamiento con rayos UV,
N-metil-N-nitroso-N-nitrosoguanidina (agente químico mutagénico) y
técnicas de manipulación genética. Mientras se estaba realizando la
investigación de los metabolitos producidos por esta nueva cepa, aparecieron
tres nuevos compuestos bastante interesantes: la milbemicina beta15 (1), secomilbemicinas E (2) y F (3) los cuales se aislaron del caldo
de fermentación de S. bingchenggensis X-4. La
estructura del compuesto 1 es similar a la milbemicina D, compuesto que
se usa como plaguicida contra nematodos (una especie de gusanos) parasitarios
de las plantas, además es muy selectivo y bastante potente, por lo que la
bioactividad del compuesto 1 debe de investigarse más. Respecto a
las secomilbemicinas previamente descubiertas, los grupos hidroxilo (OH) en el carbono situados en la posición 5, no
se encontraban en los compuestos 2 y 3. Otro dato importante es que las
milbemicinas y avermectinas obtenidas a partir de microorganismos, contienen ese grupo hidroxilo en
C-5 y los derivados de estas solo se pueden obtener mediante métodos
sintéticos, por lo que estos dos nuevos compuestos, que no presentan ese grupo hidroxilo característico en el carbono 5, pueden tener un papel
importante en la compresión y el perfeccionamiento de las vías de biosíntesis
de milbemicinas.
Para la obtención de estos compuestos se llevo a cabo una sería de procesos. En primer lugar, la cepa mutante se mantuvo en un agar inclinado, que proporciona un medio
selectivo de bajo pH útil para cultivar organismos acidotolerantes (capaces de
vivir y tolerar un pH acido) y acidófilos (crecimiento óptimo en pH de 1 a 5),
a una temperatura de 28ºC durante 12 días. Luego, este medio de cultivo se traslada a un matraz
en un reactor rotatorio a 250 rpm (revoluciones por minuto) durante 30 horas a 28°C. Una vez finalizado
este periodo de tiempo, se inocula con 0,5 L (provenientes del matraz) un fermentador
con 10 L de medio de siembra y con una capacidad máxima de 15 L. En
este fermentador se incuba durante 32 horas con una aireación y agitación
de 1VVM (vvm = volúmenes de aire por unidad de volumen de medio por minuto) y a
180 rpm.
Después de dicha incubación, se transfirieron 3 L de este fermentador de 15 L a
otro fermentador de producción con 30 L de medio de cultivo y una
capacidad máxima de 50 L. En este fermentador se mantuvo a 28 ºC, con un pH
inicial de 7.4 y se esterilizó por burbujeo de
vapor (mediante un
sparger, que es el instrumento utilizado para suministrar vapor a presión
al interior del fermentador) a 121ºC durante 30 min. Una vez
esterilizado, se realizó la fermentación durante 10 días a 28 ºC. En todo el
proceso siempre se garantizó unas condiciones apropiadas para favorecer
el proceso fermentativo.
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Tras la incubación durante 10 días, el caldo de
fermentación (33 L) se filtró. La torta (los restos obtenidos tras la
filtración) resultante fue lavada con agua, y ambos, el filtrado y el
lavado, se descartaron, ya que lo único que interesa es la torta,
donde se encuentra los productos de interés. El metanol (10 L) se utilizó para
extraer la torta lavada. Alrededor de 2 L del extracto de metanol (MeOH) fueron
evaporados a presión reducida y a 45 ºC , y el concentrado resultante se
extrajo tres veces usando un mismo volumen de EtOAc (etanoato de etilo).
Posteriormente, la fase de EtOAc combinada se concentró bajo presión para
rendir 30 g de sustancias oleosas, con las que se realizó una cromatografía
sobre un gel de sílice. Después se eluyó con petróleo y éter-acetona y se
obtuvieron dos fracciones, la fracción I y II. A la fracción I se le
sometió a una columna de Sephadex LH-20 (lecho usado para algunos tipos de
cromatografía por donde pasan o no las muestras a estudiar) en gel,
eluyendo con MeOH para así tener la subfracción I, la cual se depuró a
partir de una HPLC (cromatografía liquida de altaeficacia) para
así obtener un compuesto puro a temperatura ambiente.
En la
fracción II se procedió de la misma manera, es decir, se realizó una
cromatografía en columna de Sephadex LH-20 eluyendo también con MeOH para
obtener así la subfracción II. Esta se purificó con una HPLC semipreparativa
utilizando un disolvente (contiene una mezcla de CH3OH-CH3CN-H2O)
para obtener así un compuesto puro a temperatura ambiente, en este caso la
milbemicina β15.
Una vez que
se realizó la purificación y concentración de los compuestos, el compuesto 1 se
aisló como un aceite incoloro con UV y se estableció su fórmula molecular,
siendo esta C33H50O7 que se
deduce mediante una ionización de alta resolución por electrospray
(HRESI)
También se realizó una RMN (resonancia magnética nuclear) para descubrir la estructura de cada compuesto, y
esta técnica consiste en aplicar un campo magnético externo que va a provocar
que los núcleos de los átomos a analizar se orienten en la misma dirección que
el campo magnético externo. La radiofrecuencia utilizada para excitar estos
núcleos nos va a dar un espectro de emisión de estos núcleos, que liberarán
esta energía cuando se deje de inducir el pulso de radiofrecuencia y los
núcleos reorienten su campo magnético local a su posición inicial.
De esta forma se ha logrado extraer milbemicinas por procesos fermentativos
de una estirpe mutante de Streptomyces
bingchenggensis, que han adquirido una gran importancia biotecnológica ya que, actualmente, se utilizan como acaricidas frente a ácaros adultos de Tetranychus urticae y como nematocida contra Caenorhabditis elegans.
Integrantes
del grupo:
Ricardo Requena Platek
Guillermo del Barco Aldaz
Manuel Garrido Romero
Rubén Mollá Albaladejo
Joan Sánchez Pascual
Referencias
bibliográficas:
"New
milbemycins from mutant Streptomyces bingchenggensis X-4"
The Journal
of Antibiotics (2011) 64, 753–756; published online 17 August 2011
Bao-Xin
Zhang, Hui Zhang, Xiang-Jing Wang, Ji-Dong Wang, Chong-Xi Liu and Wen-Sheng
Xiang
