Thuggacin, nuevo macrólido antibacteriano de Sorangium cellulosum que actúa contra bacterias grampositivas.

Recientemente se ha descubierto un nuevo tipo de antibiótico de la clase de los macrólidos al que se ha llamado thuggacin. Este antibiótico es producido por el microorganismo Sorangium cellulosum. Hasta la fecha se han identificado tres subtipos: thuggacin A, thuggacin B y thuggacin C que son efectivas contra bacterias grampositivas, especialmente del género Mycobacterium (entre ellos Mycobacterium tuberculosis, agente causante de la tuberculosis).
Se están investigando los tipos de thuggacin para su uso en la medicina. Actualmente también se está tratando de descubrir si existen otros compuestos derivados, así como su producción y su uso farmacéutico.

La cepa productora del antibiótico fue aislada desde una muestra de tierra en 1993. En primer lugar se realizó una fermentación a partir de dicha cepa y después con lo que se obtuvo se aislaron los thuggacin A y B. El tipo C solo pudo obtenerse por métodos químicos a partir del A y el B o bien por otro método de aislamiento diferente al anterior. 

La fermentación para la producción de thuggacin A se desarrolló de la siguiente manera:

Crecimiento del cultivo de Sorangium cellulosum

- Inoculación → Día 0

- Fase de latencia →  Días 1 y 2:

 No varía la concentración de almidón

- Fase exponencial → Días 3 a 5:

El día 4 el almidón se agota rápidamente

El día 5 empieza la producción de thuggacin.

- Fase estacionaria → A partir del día 5:

El día 6 se agota la glucosa.

El día 7 se alcanza la máxima concentración de thunggacin A (21 µg/ml).

Los días 8 a 12 el nivel de thunggacin A permanece constante.

A continuación se vio como afectaba el antibiótico aislado sobre otro microorganismo (Micrococcus luteus) mediante el uso de marcadores radiactivos los cuales se incorparaban en ácidos nucleicos y proteínas lo que permitió seguir su síntesis. Se obtuvo la siguiente gráfica en la que se aprecia como dicha síntesis se para por completo al añadir thuggacin. 

También se estudió su efecto sobre la cadena respiratoria, para lo cual fue necesario aislar las membranas de Micrococcus luteus y comparar las diferencias en presencia y ausencia de thuggacin. 

Los resultados de la medición del consumo de oxígeno de Micrococus luteus bajo la influencia de thuggacin están representados en la figura 4. Ésta muestra que la respiración fue inhibida al 100% con 2.5 ng/ml. La máxima inhibición de la oxidación de NADH (necesario para la cadena respiratoria) alcanzó el 90% a los 10 ng/ml de thuggacin A. Se utilizó como control KCN (inhibidor conocido de la cadena respiratoria) y se observó un máximo de inhibición con 60 µg/ml que alcanzó también el 90%.

El citocromo c reducido, tuvo una inhibición similar a la inhibición de la oxidación. La figura 4 también muestra la actividad de la citocromo oxidasa utilizando NADH.

La figura 5 muestra un espectro de absorción en el que la bajada de los picos se corresponde con la inhibición de la reducción de los distintos tipos de citocromo por la influencia de thuggacin A. De acuerdo a esto se observa que produce una inhibición parcial de la reducción de citocromo a (600.9 nm), citocromo b (560.3 nm) y citocromo c (551.7 nm). Un resultado similar se obtiene con KCN.

Se utilizaron también membranas citoplasmáticas de Mycobacterium phlei, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Staphylococcus auresus Bacillus subtilis. De ellas sólo las cadenas respiratorias de M. phlei y C. glutamicum mostraron una sensibilidad similar a M. luteus por thuggacin A. El resto de bacterias presentaban resistencia debido a una cadena respiratoria mucho más activa.

Se ha visto que thuggacin actúa sobre las  etapas finales de la cadena de transporte electronico en las bacterias donde tiene actividad. La inhibición de los citocromos producida por KCN y thuggacin es diferente debido a que cada uno se une a la proteína en una región distinta (distinto sitio de unión). El mecanismo de inhibición de la reducción de todos los citocromos no es aun conocida.

Efectos biológicos de thuggacin

Thuggacin inhibía el crecimiento de algunas bacterias gram-positivas, especialmente de Micrococus luteus y de especies del género Corynebacterium y Mycobacterium. Pero la gran diferencia observada entre estos generos eran los valores de MIC (concentración mínima inhibitoria) representados en la tabla 1. Las actividades de Thuggacins A y B fueron parecidas, pero la de thuggacin C presentó mucha menos actividad. No fueron activas contra levaduras y otros hongos. Se obtuvo un dato curioso: la línea celular de fibroblastos del ratón (células de mamífero) fue algo sensible a la thuggacin A (Tabla 1), por lo que podría tener efectos secundarios sobre células animales.

OTROS RECURSOS UTILIZADOS

• Artículo original:

Herbert Irschik, Hans Reichenbach, Gerhard Höfle, Rolf Jansen.

The Thuggacins, Novel Antibacterial Macrolides from Sorangium cellulosum 

Acting against Selected Grampositive Bacteria.

THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS.

 Received: August 16, 2007 / Accepted: November 28, 2007

© Japan Antibiotics Research Association

• Patentes del antibiótico:    

Patente estadounidense:   Rolf Jansen, Brigitte Kunze, Herbert Irschik - US8114864 B2
Patente europea:              Rolf Jansen, Brigitte Kunze, Herbert Irschik - EP2089025 B1

AUTORES DE LA ENTRADA:

• Adrián Guerrero Moreno
• Adrián Hernandez García
• José David Celdrán López
• Abraham Muñiz Chicharro 
• Maria José Verdú Polvorinos

Producción de antibióticos y biosíntesis combinatoria

En la actualidad se está viendo incrementada la resistencia a antibióticos. Por esta razón los investigadores se están viendo obligados a buscar nuevos compuestos que sean efectivos frente a esta resistencia. Los cetólidos son unos nuevos antibióticos derivados de otros habitualmente utilizados tales como la eritromicina, que son capaces de acabar con microorganismos resistentes, debido a que tienen mecanismos diferentes, actuando en el mismo orgánulo (el ribosoma) pero de forma distinta.

En este trabajo se intenta simplificar la síntesis de los cetólidos, ya que la síntesis química es muy compleja, mediante biosíntesis combinatoria, que se basa en la combinación de las rutas metabólicas de diferentes microorganismos, aprovechando las características que interesan de cada uno. En este caso se utiliza dos microorganismos: Streptomyces venezuelae y Saccharopolyspora erythraea.  Modifican la ruta de S. erythraea introduciendo una enzima característica de S. venezuelae, por lo que se consigue obtener el producto deseado.

La ruta se ha modificado utilizando técnicas de ingeniería genética realizando dos pasos principales. El primer paso para obtener el compuesto que buscan los investigadores es la deleción de un gen que codifica una enzima importante en la ruta, dirigiéndola hacia la síntesis del compuesto. Para poder eliminar este gen, las bacterias se transforman con un plásmido que tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma del microorganismo de tal forma que suprime el gen. Una vez obtenido el mutante, se comprueba mediante tres experimentos que se ha eliminado el gen que les interesa. El primero de ellos se basa en la selección mediante antibióticos, y una vez seleccionadas estas cepas, se comprueba mediante una hibridación de Southern, en la cual aparecerá una banda de menor tamaño en aquellas cepas que hayan sufrido la deleción. 

(A) Esquema genético de las cepas de S.erytraea: silvestre (arriba) y mutante (abajo).
(B) Análisis de restricción de Southern: 1-Cepa silvestre. 2-Cepa mutante. 3-Cepa mutante a la que se ha vuelto a insertar el gen delecionado para comprobar que efectivamente se había eliminado el gen de interés.

El último control es la adición de un nuevo plásmido que contiene el gen y que además es capaz de expresarlo, si el gen que se había sustraído era este, se recuperará el fenotipo silvestre. Esto se comprueba a través de la comparación de dos cromatografías, una de los compuestos obtenidos en la estirpe silvestre y la otra de las cepas transformadas con este segundo plásmido. Si se hubiera delecionado otro gen, no aparecerían los mismos compuestos.

El segundo paso es la introducción del gen que codifica una enzima de Streptomyces venezuelae que les permite obtener el compuesto deseado a partir del producto de la nueva ruta de S.erythraea. Este gen se encuentra en la naturaleza en Streptomyces venezuelae, por lo que primeramente se extrae de este microorganismo, se amplifica por PCR y se inserta en un plásmido. Este plásmido se utiliza para transformar las cepas seleccionadas anteriormente, y permite la integración del gen en el cromosoma de la célula. Para comprobar esta integración se realiza una hibridación de Southern, en la cual aparecerá una banda de mayor longitud en aquellas cepas que se haya integrado. También se realizan dos cromatografías, distinguiendo entre los compuestos producidos por la cepa con o sin este gen. En la primera aparecerán dos picos, uno correspondiente al intermediario y otro al producto que se quiere obtener pero en menor media, ya que el rendimiento de esta última enzima es bajo. Al obtener el espectro de la cromatografía, se deduce que
hay poca cantidad del compuesto deseado.

Comparación de cromatografías llevadas a cabo: (B) Cepa mutante de S.erytraea (D) Cepa mutante de S.erytraea con el gen de interés de S.venezuelae, se observa un pico pequeño correspondiente al compuesto que se busca obtener.

En conclusión han conseguido un nuevo método de obtención de cetólidos que reduce el proceso global, gracias a la utilización de microorganismos como productores transgénicos. Esta técnica aún está por mejorar, ya que el rendimiento obtenido es muy bajo y no puede tener aplicabilidad industrial debido a los procesos de purificación, pero es un gran paso frente al problema creciente de la resistencia a antibióticos.

Trabajo realizado por:

Lucía Almagro Ruz

Lucía Juan Vicente

María Sánchez Pérez

Eva Mª Villalba Riquelme

Iris Sánchez Vergara

Bibliografía:

Devi B. Basnet, Je Won Park, Yeo Joon Yoon

Combinatorial biosynthesis of 5-O-desosaminyl erythronolide A as a potent precursor of ketolide antibiotics

Journal of biotechnology, 11 de Marzo de 2008

New method for isolating antibiotic-producing fungi

Autores: Mio Kawaguchi, Kenichi Nonaka, Rokuro Masuma y Hiroshi Tomoda.

Componentes del grupo: Abdelmonim Bernia, Nuria Castejón Navarro, Ainoa Gallego Zaragoza, Carlos Hernández Cortés y Niurka Martínez Morales.

Palabras  clave: Compuesto bioactivo,  metabolitos secundarios,  etnomicología, antifúngico, Candida albicans, inoculación.

    1.- INTRODUCCIÓN

Es bien sabido que los hongos siguen siendo una de las fuentes más importantes para el descubrimiento de  nuevos  compuestos  bioactivos.  De  la  historia  del  descubrimiento de  fármacos a partir de microorganismos, los metabolitos secundarios de los hongos han proporcionado un importante número de fármacos, tales como el antibiótico penicilina, el inmunosupresor c y los agentes antihipercolesterolémicos lovastatina y compactina.

La Etnomicología podría definirse como el estudio de los usos de los hongos por las diversas culturas; ya que los hongos son organismos  que  desde  siempre  han  sido  empleados  para  los  más diversos y extraños menesteres.

El cuerpo humano alberga normalmente una gran variedad de microorganismos que incluyen bacterias  y  hongos.  Entre  estos, algunos  son  útiles  para  el  cuerpo, otros  no  producen  ni  daño  ni beneficio y unos cuantos pueden provocar síntomas, a veces, dañinos. Este último, es el caso del microorganismo de interés: Candida albicans, que es una  levadura que  vive  en  casi todas partes, incluyendo el cuerpo humano. Se encuentra   normalmente en pequeñas cantidades en la vagina, la boca, el tubo digestivo y en la piel; y, por lo general, el sistema inmunológico mantiene los hongos bajo control.

Muchos de estos antibióticos han sido descubiertos a partir de microorganismos, por  un proceso que incluye varias etapas:

1) Aislamiento de microorganismos principalmente del suelo (2-3 días).

2) Purificación de los cultivos de los microorganismos aislados (3-5 días).

3) Identificación de los microorganismos aislados principalmente por características morfológicas para eliminar cepas duplicadas (14-21 días).

4) Comprobación   de si los caldos de cultivo o extractos de microorganismos que muestran actividad antimicrobiana para seleccionar microorganismos candidatos que produzcan antibióticos (7-8 días).

5) Resuspensión de los microorganismos seleccionados para obtener la reproductibilidad de la actividad antimicrobiana (6-8 días).

Este proceso rutinario (llamado en este estudio “método tradicional”) lleva normalmente 5-7 semanas. Lo que pretende este estudio es mostrar un método más eficiente y rápido para seleccionar los hongos que puedan producir antibióticos anti-Candida albicans.

     2.- MATERIAL Y MÉTODOS

Medios para el aislamiento de hongos

 

            Se usaron cuatro medios para el aislamiento de hongos de las muestras de suelo y se añadió kanamicina a todos para proteger las muestras contra el crecimiento de bacterias ajustados a pH 6,0 antes de la esterilización.

           En el método A las muestras de suelo se pusieron en una placa de plástico y cada uno de los cuatro medios se fundieron para ser vertido en las placas, mezclándose bien para dispersar la muestra; se produjo un rápido crecimiento de hongos como Trichoderma, Aspergillus y Penicillium inhibiendo el crecimiento de otros hongos.

           En el método B las muestras de suelo muy diluidas se suspendieron en tampón Winogradsky. Por este método de revestimiento se aislaron las colonias de hongos como las especies Virgaria y Humicola, de crecimiento lento.

           Ambos métodos fueron usados para preparar las placas de suelo que fueron incubadas a 27°C durante 2-3 días para formar colonias fúngicas.

           El  objetivo  fundamental  de  este  estudio  fue  observar  directamente  el  crecimiento  de  las colonias de hongos derivadas de las muestras de suelo que mostraban efectos antagónicos para el crecimiento de C. albicans.

 Inoculación de C. albicans en placas de suelo

           Se probaron para ello 5 métodos de inoculación de C. albicans:

   - En  el método I, C.  albicans y  la  muestra de suelo se  mezclaron e  incubaron al  mismo tiempo.

   - En el método II, C. albicans se preparó en primer lugar en un medio de agar; y la placa que contenía la muestra de suelo en agar se puso encima y se incubó a continuación.

           En estos dos métodos, C. albicans patógena y el hongo derivado del suelo, comenzaron a crecer al mismo tiempo obteniéndose, como resultado, un recubrimiento de la placa  con C. albicans (figura 1a) porque creció mucho más rápido que la muestra de suelo, los cuales no pudieron formar colonias. Ello supuso que no se pudieran observar efectos antagonistas en las placas.

   - En  el  método  III,  C.  albicans  se  extendió  en  las  placas  de  suelo,  después  de  que formasen  colonias  tras  2-3  días  a  27°C.  Desafortunadamente, C.  albicans  no  creció  de manera uniforme en la placa (figura 1b).

    - En el método IV, Las muestras de suelo se extendieron sobre la placa de C. albicans después estas últimas formaran colonias (2-3 días de incubación a 27°C); sin embargo, las muestras de suelo al crecer no quedaron repartidas de forma uniforme por la placa de C. albicans (figura 1c).

     Establecimiento del método de inoculación V

           Para establecer este método, se estudió la concentración de  C. albicans que debía poseer la suspensión para  pulverizar la  placa, así como el proceso de formación de  los derivados fúngicos del suelo.

           El atomizador usado en este estudio puede pulverizar una solución de 40 μl. Se probaron cinco concentraciones diferentes de suspensiones de  C.  albicans para pulverizar en la placa de suelo y se comparó el crecimiento de C. albicans después de 1-3 días de incubación a 27ºC.

           La figura 2 muestra que las colonias de C. albicans pulverizadas en la placa de agar (sin muestra de suelo), tras un día de la inoculación, crecieron rápidamente. Se puede deducir,  pues, que una incubación de un día era suficiente para que C. albicans pudiera formar colonias,  siendo las más adecuadas para el estudio las obtenidas en las placas (C) y (D).

      Más tarde, las placas del  suelo se  prepararon por el  método de  recubrimiento A o  B y se incubaron a 27ºC   y, después   de 2 o 3 días de incubación para formar las colonias,  la suspensión de C. albicans se pulverizó sobre las mismas, dentro de una bolsa de plástico instalada en la campana (figura 3). Tras un día de incubación a 27ºC, se seleccionaron las colonias que mostraban efectos antagónicos sobre el crecimiento de C. albicans (figura 4).

  Identificación taxonómica del hongo

         La identificación taxonómica se llevó a cabo mediante la observación de la disposición de los conidióforos y la forma en que se produjeron las esporas, y por el crecimiento del hongo en agar.

  Ensayo de la actividad anti-C.albicans

            Para confirmar la producción de antibióticos anti-fúngicos por cepas seleccionadas, se inoculó con un asa de siembra las cepas de LCA en un tubo de prueba que contenía uno de los medios (1-4). El tubo sería incubado en un agitador rotatorio a 27ºC durante 6 días. Posteriormente, se midió la actividad anti-C. albicans por el método de difusión en agar usando discos de papel.

3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN

             Se vio que la inoculación de C. albicans por los métodos I – IV no eran adecuados para el propósito final; por lo que, se ensayó otro método para superponer C. albicans en una placa de suelo por pulverización (método de inoculación V).

Taxonomía de las 26 cepas seleccionadas

     Los resultados de la taxonomía de las 26 selecciones, se observan en la siguiente tabla:

             En este estudio, se ha establecido un método eficaz y rápido para un aislamiento directo de hongos a partir de muestras de suelo que pueden producir antibióticos anti C. albicans. Para ello se dispersó por pulverización después de que las colonias derivadas del suelo se hubieran formado en las placas (en 2 o 3 días). Después de un día de incubación, se seleccionaron las colonias que mostraban un efecto antagónico en el crecimiento de C. albicans.

           De esta forma, en una semana, se seleccionaron 151 hongos candidatos de 18 muestras de suelo y, de entre ellos, 26 hongos mostraron actividad anti-C. albicans en sus caldos de cultivo.

           Como se resume en la tabla 1, Penicillium fue el género seleccionado que más antifúngico produce y fue el más aislado (16/26), seguido de Trichoderma (3/26).

           Por lo tanto, este método permite obtener productores de antibióticos de hongos procedentes del  suelo en un tiempo más corto (2 semanas vs.  5-7 semanas) y con una tasa mayor (17,2% frente a 3,1%) que el método tradicional.

4.-CONCLUSIÓN

             En este estudio se ha conseguido obtener un método más eficaz y rápido para el aislamiento de hongos con actividad antifúngica. Cabría esperar que este método sea aplicable para el aislamiento de microorganismos derivados del suelo (hongos y actinomicetos de rápido/lento crecimiento) que muestren efectos antagonistas en otros microorganismos patógenos.       

          Se obtendría así una optimización de los resultados en un periodo de tiempo más corto gracias a los avances científicos y tecnológicos; lo cual supondría un mayor aprovechamiento del tiempo en la resolución de problemas y/o búsqueda de tratamientos/soluciones a los mismos. Además de un mayor ahorro a la hora de mantener los cultivos.

Referencia Bibliográfica: The Jounal of Antibiotics (2013) 66, 17-21