Nuevo enfoque espectrofotométrico para la determinación de Validamicina A en la fermentación de Streptomyces hygroscopicus

 

La Validamicina A (Val-A) es un agro-antibiótico antimicótico (o antifúngico), producido por la bacteria Streptomyces hygroscopicus 5008 en la fermentación industrial y muy utilizado, especialmente en Asia, para la protección de plantas contra enfermedades producidas por Rhizoctonia.

Para la determinación de su producción se utiliza el análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Esta técnica permite separar los componentes de una mezcla basándose en las diferentes interacciones químicas entre la sustancia analizada y la columna cromatográfica. Sin embargo, este y los otros métodos que hoy se conocen, presentan inconvenientes cuando se quieren analizar muestras grandes.

Actualmente, se está intentando desarrollar un nuevo método basado en espectrofotometría (medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda) para la determinación de Val-A ya que, cuando esta es sintetizada, es secretado simultáneamente el pigmento melanina. Además, se observa una relación estable entre la concentración de Val-A y el valor de absorción espectral (SA) del pigmento a 450 nm. Por tanto, el método espectrofotométrico permite determinar la producción de Val-A de forma rápida y sencilla. 

Para comprobar su validez, se comparó la productividad de Val-A por el método de HPLC con el método de SA y, con este último,  se observaron resultados positivos que permitían encontrar con éxito cepas con alta productividad de Val-A y tiempo corto de fermentación.

Además, en muchas cepas el antibiótico y el pigmento son regulados por el mismo factor y sus producciones están relacionadas. Por tanto, en la fermentación de Streptomyces hygroscopicus 5008 se podría establecer una ecuación basada en la relación entre el valor de la absorción espectral del pigmento y la concentración de Val-A en el caldo. 

Por tanto, en este trabajo lo que se pretende es establecer un método preciso, rápido y barato utilizando un medio industrial y una cepa de fermentación para cuantificar la producción de ValA y, el método espectrofotométrico anteriormente descrito, podría ser una buena alternativa. Igualmente,  esta investigación también puede ser aprovechada para encontrar antibióticos en aquellas cepas productoras de pigmento.

Para llevar a cabo el experimento se cultivó la cepa S. Hygroscopicus 5008 en placas de agar con harina de soja y maltosa. Se recogieron las esporas desarrolladas y se suspendieron en glicerol durante 7 días a 37ºC. Dicha suspensión de esporas fue cultivada y posteriormente fermentada.

Por otro lado, había que comprobar si el pigmento producido durante la biosíntesis de Val-A era estable. Se examinó su estabilidad térmica, de la luz y la capacidad de resistencia al medio alcalino. A continuación, se comparó el valor de absorción espectral de las muestras de pigmento almacenado en las distintas condiciones. 

El siguiente paso fue la medición de la producción de Val-A. Para ello se tomaba una alícuota del caldo de fermentación cada 24 horas a las que se sometía a posterior centrifugación. Se mezclaba el sobrenadante resultante con cloroformo y, la fase acuosa superior la cual contenía

Val-A y el pigmento, se filtraba desechando la fase orgánica inferior que presentaba proteínas y otros contaminantes. Este sobrenadante filtrado se pasa a un nuevo tubo para las siguientes pruebas. 

A continuación, para llevar a cabo la validación del método espectrofotométrico para la determinación de Val-A, se tomaron tres muestras del tubo anteriormente mencionado cada 24 horas. El valor de SA del pigmento secretado y la producción de Val-A detectados mediante HPCL se ajustaron a una ecuación mediante el software STATA. Se probó que el experimento era repetible y se correspondía con dicha ecuación. 

Por otro lado, para eliminar el efecto de los diferentes componentes del medio que puedan afectar en el color del caldo de fermentación se seleccionaron tres medios: el medio A (descrito anteriormente), el medio B (polvo de arroz, harina de soja, NaCl KH₂PO₄ y CaCO₃) y el medio C (almidón soluble, extracto de levadura, KH₂PO₄ y NaCl). 

También se evaluó la aplicabilidad de la espectrofotometría en la estimación de la producción de Val-A utilizando muestras en condiciones de fermentación diferentes. Lo que se pretendía era observar la relación entre el pigmento y la productividad de Val-A cuando se añadía un estimulante exógeno, el cual se había demostrado que mejoraba la productividad de Val-A. Dado que el pH es un factor importante que influye en el metabolismo microbiano y en el color de pigmento se realizaron varios experimentos variando el pH. 

Por último, se generaron cepas mutantes (mediante irradiación ultravioleta y N-metil-NO-nitroN-nitrosoguanidina) para seleccionar aquellas cepas de Val-A que tuvieran alto rendimiento.  

Se ha estudiado la estabilidad del pigmento en diferentes condiciones anteriormente descritas, por lo que el pigmento se relaciona con la producción de Val-A. Como se muestra en la Fig. 1, el crecimiento de S. hygroscopicus 5008, junto con la producción de  Val-A, condujo a una serie de cambios regulares en el color del caldo de la fermentación. La producción de pigmento y Val-A en condiciones óptimas de cultivo mejoraban ambos su producción, mientras que en condiciones desfavorables, sus metabolismos eran suprimidos. En el análisis transcripcional de los genes de biosíntesis de Val-A y la respuesta del gen relacionado con el pigmento, se demostró que presentaban cooperatividad en diferentes condiciones de fermentación, por tanto, ambos están regulados por los mismos reguladores.  

 

 

Fig 1. Cambio de color del caldo de fermentación en la producción de Val-A. 

Es posible determinar que existe una relación estable con la producción de Val-A y la correlación entre el color del caldo, por lo que la producción de Val-A podría ser la base del método de espectofotometría. Se escogió el valor de 450 nm para medir la absorbancia de la melanina  (pigmento),  que presentaba una relación constante a dicho valor, el cambio se producía debido a la concentración de Val-A de las muestras. Esto llevó a que 450 nm se estableciera como la longitud de onda de detección para establecer la fórmula de ajuste de la producción de Val-A. 

El siguiente paso es la determinación de la fórmula de ajuste en el ensayo de espectofotometría. Para obtener la ecuación tomamos como variables los valores de la concentración de Val-A (Y) determinados por HPLC y el valor de SA a 450 nm (X): 

 El coeficiente de determinación de la ecuación es 0,9928, por lo que muestra un alto grado de ajuste. En la FIG 2., se muestra la curva de ajuste correspondiente a 40 muestras en diferentes cultivos o condiciones de fermentación. 

 

FIG 2. Curva de ajuste de la relación entre la producción de Val-A y el valor de DO (densidad óptica) del pigmento 

Los resultados en unas condiciones de fermentación deben ser verificados por test para una probabilidad dada, normalmente p=0,05. Los ensayos de este trabajo han sido validados por el t-test. El método de HPLC para la determinación de Val-A ha sido ya verificado, por lo que se comparó con el método SA a este.  

 

En la Tabla 1, a diferentes tiempos de fermentación todos los valores de p son superiores a 0,05 (2ª columna), por lo que en el intervalo de confianza del 95% no hay diferencia entre las concentraciones de Val-A detectadas por HPLC y por SA.  

El mayor R.S.D (Desviación Estándar Relativa) en SA es de 0.212 correspondiente a las 48 h, al no ser en este momento el de mayor secreción de Val-A ni de pigmento, esta desviación puede ser aceptada. A las 96 h, es el momento de máxima producción de Val-A. Las R.S.D correspondientes a HPLC y SA a este tiempo son 0.027 y 0.007 respectivamente, lo que confirma que el método SA tiene una buena estabilidad al igual que el método HPLC. 

En los ensayos para la verificación de la viabilidad del método SA se llegó a conclusiones tales como que la productividad de Val-A es mayor a una Tª relativamente más alta junto a una síntesis de proteínas y consumo de azúcar más rápidos. Para verificar la exactitud, repetibilidad y aplicabilidad de la ecuación de ajuste para la determinación cuantitativa rápida de Val-A, se compararon diferentes medios y condiciones de fermentación, tales como la adición de gbutirolactona, etanol, pH, etc. Se comparó una vez más con el método HPLC quedando recogido en la Tabla 2. Además, se analizó la precisión de la espectofotometría a las 120 h, tiempo en el que finaliza la fermentación. Todo mediante la t-test.  

 

Si tanto el valor Pr (T <t) como el de Pr (T> t) [Pr (T> t)=1-Pr (T <t)] son superiores a 0,05, se considera que la hipótesis es aceptada. El resultado demostró que no existía ninguna desviación del paralelismo en este estudio, por lo tanto, el método SA establecido podría considerarse tan exacto como el método HPLC. Aunque los cambios en los cultivos y condiciones de fermentación afectaran a la producción de Val-A y el metabolismo de S. hygroscopicus 5008, se mantenía la relación entre  Val-A y el valor SA, por lo que no afecta a la exactitud y estabilidad de los valores predictivos calculados por la ecuación de ajuste.  

El pretratamiento de muestras no introduce sustancias que puedan afectar a la DO del caldo a 450 nm y el pigmento puede ser estable en un entorno común durante mucho tiempo. Como el método SA se basa en la densidad óptica del pigmento, podría utilizarse para investigar la relación entre la producción de antibióticos y la secreción de pigmentos desde la perspectiva del metabolismo microbiano. Siempre que se pueda obtener una relación cuantitativa y estable, el método SA se podrá utilizar para cuantificar otros antibióticos en la fermentación. 

La cuantificación de Val-A por método de HPLC es precisa, pero el equipo y los reactivos relacionados para HPLC cuestan mucho. El tiempo de análisis para una muestra es de unos 20 minutos, sin incluir la preparación de reactivos, requiriendo todo esto para un gran número de muestras. Todo esto hace que no sea un buen método para la fermentación industrializada, en contra, el método SA no necesita instrumental y reactivos costosos, y además, una gran cantidad de muestras pueden ser analizadas en la placa de 96 pocillos a la vez.  

 

FIG 3. Cribado de mutantes de alto rendimiento por el método SA en placa de 96 pocillos y análisis comparativo de la producción de Val-A mediante método SA y HPLC. Cinco días cultivo wild type 5008 y siete mutantes en dos medios diferentes. (A) La producción de Val-A en el quinto día por el método SA y por HPLC representado en gráfico de barras (B).

El método de ensayo SA descrito en placa de 96 pocillos se utilizó para determinar la productividad de Val-A y el cribado de alto rendimiento  (Fig. 3). Siete mutantes se compararon con los de tipo salvaje 5008 (WT). La productividad de Val-A por el método de SA fue comparada con el método de HPLC. El mutante 4 (M4) fue determinado como la cepa positiva con la mayor productividad (Figura 3B). Además de una selección rápida y conveniente de Cepas, el tiempo de fermentación de los mutantes puede estimarse utilizando SA como un método de monitorización rápido en tiempo real Val-A. También es posible emplear el método SA para cepas con tiempos de fermentación cortos, por lo que es un método con amplias posibilidades de aplicación. Por ahora, no existe un método de prueba rápido de Val-A que pueda satisfacer la demanda industrial ni el ensayo SA en la determinación cuantitativa de antibióticos.  

Referencia bibliográfica:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172316301153?via%3Dihub

Más información acerca de Rhizoctonia:
http://www.cyclamen.com/es/profesional/enfermedades/8/22

Nombres:
Gracia Patricia Mínguez Marco
Carmen Mateu Olivares
Ana Mª Rodríguez Lozoya
Alba Mª Carrascosa Costa
Laura Serrano Arratia
Carmen Molina Pardines 

"Continuous fermentation of clarified corn stover hydrolysate for the production of lactic acid at high yield and productivity".

El ácido láctico es un compuesto químico muy utilizado hoy en día como conservante y acidulante en la industria alimentaria, pero también en la industria química como solubilizante y agente controlador del pH. Además, su forma polimérica (ácido poliláctico o PLA) puede utilizarse para la producción de plásticos biodegradables, el desarrollo de sistemas de suministro de medicamentos, suturas quirúrgicas,  o incluso para la creación de productos de consumo desechables. De hecho, se espera que la demanda del ácido láctico aumente significativamente como consecuencia del incremento en el interés por el ácido poliláctico, tal y como podemos observar en las siguientes gráficas:

Comparación del acido láctico y del poliláctico. Fuente

Aunque la obtención industrial de ácido láctico se inició hace más de 100 años, las numerosas aplicaciones que hemos nombrado hacen que la investigación siga activa y se busque una mejora del proceso y una disminución de los costes. Para ello un factor importante es utilizar sustratos más baratos (como la biomasa lignocelulósica); pero también microorganismos más eficientes. Ésta biomasa lignocelulósica puede separarse en sus componentes, lignina, celulosa y hemicelulosa, que tienen diversos usos para la obtención de bioelectricidad, de biofuel y bioproductos derivados del ácido láctico.

Usos de la lignocelulosa. Fuente

Generalmente, se produce gracias a la fermentación microbiana de almidón o azúcares con rendimientos de más del 90% en comparación con el rendimiento teórico. Sin embargo, nosotros vamos a hablar de su producción a partir de fuentes renovables, como la biomasa lignocelulósica, que a parte de eliminar la competencia con alimentos o piensos y ser una alternativa barata, ayudaría a disminuir la huella de carbono.

La mayoría de las bacterias del ácido láctico conocidas actualmente requieren esterilidad, no son capaces de convertir pentosas, y se inhiben con la presencia de productos de la degradación de azúcares como el furfural, ácido acético, o HMF.  Además, la producción está limitada al uso de cultivos puros que requieren costosos sistemas de reactores, en condiciones de alta esterilidad, y con el uso de materias primas de azúcares muy puras. Por ello, se han buscado en éste estudio microorganismos más eficientes, como es el caso de Bacillus coagulans (estirpe AD), una bacteria ácido láctica esporogénica y homofermentativa, que crece bien en biomasa lignocelulósica hidrolizada y utiliza azúcares de 5 y 6 carbonos para la producción de ácido láctico. El objetivo que se persigue es el de “Evaluar la productividad y el rendimiento de la producción contínua de ácido láctico, utilizando un cultivo aislado de Bacillus coagulans (estirpe AD)”, para lo cual se ha planteado la siguiente hipótesis: “Producir ácido láctico con un alto rendimiento a partir de biomasa lignocelulósica en condiciones no estériles, de forma que se puedan abaratar los costes del proceso de producción”.

Las bacterias del ácido láctico se utilizan para la conversión de los azúcares de varias fuentes, incluyendo la biomasa. Sin embargo, ésta deberá ser pretratada de forma que se destruya su estructura y se liberen los azúcares que serán el verdadero sustrato de los microorganismos. Tradicionalmente, los pretratamientos de biomasa lignocelulósica se acompañan de la adición de productos químicos tales como ácidos minerales o base, lo que afectará a la separación y purificación del producto final, así como un coste adicional. Éstos procesos de pretratamiento suelen dar lugar a grandes cantidades de productos de la degradación de azúcares tales como furfural y 5-(hidroximetil)furfural (HMF) que se consideran potenciales inhibidores de la fermentación para los productores de ácido láctico. Para evitarlos, una buena opción es recurrir a una explosión húmeda con posterior hidrólisis enzimática. Además, fue fue suplementado con 2% wt licor de maíz fermentado.

Una vez se tenía preparado el medio de cultivo y elegido el inóculo, se introdujeron en un fermentador continuo, el cual operaba en condiciones de anaerobios y estaba en agitación continua. El hecho de que se haya elegido este sistema y no otro es porque, tal y como se había descrito en otros estudios previos, la fermentación continua conlleva una mejor productividad en la obtención de lactato, ya que la inhibición por acumulación de productos de la degradación de azúcares es mínima. Es importante recalcar que antes de empezar el experimento se esterilizó el biorreactor con una solución de etanol al 70%, para evitar cualquier tipo de contaminación proveniente de un uso anterior.

Para poder optimizar el proceso, se instalaron sistemas de control del pH, temperatura, de la concentración de nutrientes y de regulación de la velocidad de dilución. La composición del efluente era analizada cada cierto tiempo, mediante una cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), de tal forma que cuando se variaban los factores anteriormente mencionados, se representaban los datos recogidos en gráficas para poder estudiar cómo variaba la productividad y el rendimiento.

De todas las combinaciones realizadas, las más óptimas resultaron ser un pH de 6.0, temperatura de 50ºC y una velocidad de dilución 0.167h-1. Con ello, se consiguió alcanzar un rendimiento de 0.95 g de azúcares y una productividad de 3.69 g/L/h.

Estos factores La velocidad de dilución influye en la productividad  de forma directamente proporcional, es decir, si aumentamos la velocidad de dilución (DR), aumentará también la productividad. Sin embargo, no se observa  ya que al disminuir esta el rendimiento disminuye consecutivamente y sin embargo no hay una relación clara con el rendimiento. Lo que sí que está claro es que el rendimiento a una velocidad de dilución baja es ligeramente inferior cuando lo comparas con el correspondiente a una DR alta. Se cree que esto es una consecuencia directa del tiempo de residencia en el tanque de fermentación, cuanto más se alargue dicho tiempo habrá una mayor acumulación de productos que inhiban el crecimiento microbiano.

Metabolismo homolactico vs Metabolismo heteroláctico. Fuente

Esto parece contradictorio con estudios previos, pero es que en esos casos utilizaban bacterias con un metabolismo heteroláctico (B.coagulans estirpe TB/03), sin embargo, B.coagulans estirpe AD posee un metabolismo homoláctico. La principal diferencia entre ambos tipos de es que en el homoláctico se obtienen dos lactatos por molécula de glucosa, mientras que con el heteroláctico se obtiene un lactato, un etanol y un CO2 por molécula de glucosa.

En cuanto al pH se observa que al igual que la velocidad de dilución influye en la productividad de forma directamente proporcional. En el rendimiento tampoco se observan cambios significativos, pero sí un cierto aumento con el incremento de pH. Este factor es importante puesto que pequeños cambios tendrán un efecto en el metabolismo que influirá en la productividad.

Todos esto es contradictorio a estudios previos, que afirmaban que no había cambios significativos en el rendimiento y la productividad como consecuencia de los cambios en el pH y DR. En el hidrolizado de rastrojo de maíz que se utilizaba como fuente de alimento en el medio de cultivo había azúcares de 5 carbonos como la xilosa y de 6. Pues bien, la explicación se podría encontrar en el consumo de dichas pentosas. Para ello se estudió el efecto combinado del pH y de la velocidad de dilución en el consumo del hidrolizado de rastrojo de maíz.

Manteniendo el pH constante a 6.0 que como se había visto era lo ideal, y a una temperatura de 50ºC se vió cómo variaba la conversión de dichos azúcares al aumentar la DR. Con respecto a la glucosa no se vió ningún efecto, pero en la xilosa sí se observó una disminución. Como resultado de ello, el lactato producido disminuyó desde 35.2 g/L a una velocidad de dilución de 0.02 h-1 hasta 22.3 g/L a una DR de 1.67 h-1 . Para mejorar este consumo, lo que se hizo fue mantener las condiciones constantes a un pH de 5.5 y una DR de 0.01 h-1 y cuando se estabilizaron las concentraciones, se cambió bruscamente el pH a 6.0 y la velocidad de dilución a 0.02  h-1 . Esto provocó un cambio inmediato en el consumo tanto de glucosa y de xilosa para producir lactato. Es más, las concentraciones de los azúcares rozaron los 0 g/L mientras que la concentración de lactato rondaba los 42 g/L. Este efecto se atribuye a la adaptación de las bacterias a las nuevas condiciones fermentativas que traen consigo un aumento de la cinética bioquímica.

Para finalizar, la siguiente tabla recoge las condiciones en las que se ha conseguido obtener el máximo rendimiento y la máxima productividad.

Condiciones de máximo rendimiento y productividad. Fuente

Bibliografia:

Continuous fermentation of clarified corn stover hydrolysate for the production of lactic acid at high yield and productivity 

Birgitte K. Ahring, Joseph J. Traverso, Nanditha Murali, Keerthi Srinivas.

Biochemical Engineering Journal (Impact Factor: 2.47). 01/2016; 109(109):162-169. DOI: 10.1016/j.bej.2016.01.012

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Amylolytic+bacterial+lactic+acid+fermentation+%E2%80%94+A+review

Grupo:

Isabel María Maestre Pérez

Silvia Morata Pérez

Iván López González

Sonia Marhuenda Castillo

Esther Barceló García

Producción de pigmentos por Monascus purpureus

¿Nunca os habéis planteado por qué hay camisetas rojas si la lana o el algodón son de color blanco? ¿O por qué la paella es amarilla? Pues bien, esto es gracias a los colorantes y pigmentos. Los pigmentos naturales eran los más utilizados en el siglo XIX en el ámbito textil pero hoy en día la gran mayoría son sintéticos ya que presentan numerosas ventajas. Pero como no todo en esta vida es de color de rosa, presentan además inconvenientes tales como un efecto negativo sobre el medio ambiente. Frente a esto se están buscando una serie de alternativas, como el uso del género Monascus para la producción de pigmentos naturales. 

Os presentamos a la especie Monascus purpureus, que es con la que se ha trabajado. Esta especie es un moho que puede crecer en muchos ambientes fáciles de reproducir. Para este proceso se ha utilizado la fermentación en estado sólido, ya que presenta un menor coste porque los sustratos utilizados proceden de residuos de la industria agroalimentaria. 

Como sustrato se utilizó el raquis de la espiga del maíz, ya que es mucho más barato que otros residuos. La fermentación produjo una concentración más alta de pigmento rojo usando el maíz que usando otros residuos agroindustriales ya que está formado por azúcares fácilmente digeribles por las enzimas de Monascus.

A simple vista esto parece muy fácil, pero ¿cómo se ha llegado a la conclusión de que Monascus es una buena opción para producir pigmentos? La respuesta es bastante obvia, se han estudiado los factores que afectan al crecimiento del hongo y, por tanto, a la producción de pigmento. 

Maíz sin fermentar (izquierda) y fermentado por M. purpureus (derecha)

En los experimentos que se comentan a continuación se midió la biomasa y la producción de pigmentos amarillos (longitud de onda a 412nm) y de pigmentos rojos (longitud de onda a 500nm). 

• pH: se observó que a pH bajos (1-2) y altos (>8) se inhibe la producción de pigmentos. A partir de pH 2 comienza la producción de pigmento alcanzando a pH 5 la producción máxima de pigmento rojo y a pH 6 de pigmento amarillo. Como se muestra en la gráfica, a partir de pH 6 la producción comienza a disminuir. 

• Temperatura: M. purpureus es un organismo mesófilo (Tª óptima de crecimiento entre 15-35ºC) y, como es normal, tiene un máximo de producción de pigmento a 30ºC. Como todo en exceso es malo, si aumentamos mucho la temperatura, la producción se reduce drásticamente.

• Tamaño del inóculo: si tenemos una pequeña cantidad de hongo la biomasa será insuficiente y habrá poco producto, mientras que a grandes cantidades de hongo, se producirá biomasa excesiva y se agotarán los nutrientes. Como se representa en la gráfica, con un tamaño de inóculo de 4 mL se obtiene la máxima producción de pigmento. 

• Tiempo de incubación. Si se mantiene al hongo durante 168 horas será capaz de producir una máxima cantidad de pigmento. Sin embargo, si se deja incubar mucho más tiempo la cantidad de pigmento empieza a disminuir debido a la fase de muerte. 

• Humedad. Lo mejor es un punto intermedio, porque si hay mucha humedad disminuye el oxígeno disponible y si hay poca lo que ocurre es que hay menos disponibilidad de nutrientes. Este punto intermedio es el 60% en el cual la producción de pigmento es máxima. 

Una vez que se ha visto cómo afectan los factores externos a Monascus purpureus, para dar el visto bueno a esta alternativa se debe comprobar la estabilidad del pigmento. Entonces se observó que las variaciones del pH afectan al color del pigmento, que es termoestable (no sufre alteración por variaciones de temperatura) y que es no higroscópico (no absorbe la humedad). En conclusión, con este procedimiento se consigue abaratar la producción de pigmentos y aumentar el rendimiento, además de no producir daños en el medio ambiente. 

Todo este trabajo no hubiese merecido la pena si no lo hubiesen realizado pensando en una meta futura, que sería la aplicación en la industria farmacéutica, en cosmética, en la industria textil y en la alimentaria. Cabe destacar la producción del arroz de levadura rojo en países asiáticos y su uso como sustituyente de nitritos en el curado de la carne, disminuyendo los riesgos de padecer cáncer por el consumo excesivo de estos productos. 

Bibliografía

Palanivel Velmurugan, Hyun Hur, Vellingiri Balachandar, Seralathan Kamala-Kannan, Kui-Jae Lee, Sang-Myung Lee, Jong-Chan Chae, Patrick J. Shea, Byung-Taek Oh. "Monascus pigment production by solid-state fermentation with corn cob substrate". Journal of Bioscience and Bioengineering; Sept 2011 doi:10.1016/j.jbiosc.2011.08.009

Autores del blog

Raquel Andreu Ivorra
Rocío Díaz Puertas
Daniel Esteve Moreno
Miriam Gámez García
Oana Solovastru

Mejora de la producción de metabolitos secundarios en Streptosporangium

Improved secondary metabolite production in the genus
Streptosporangium by optimization of the fermentation
conditions

Christoph Pfefferle, Uwe Theobald, Hanne Gürtler, Hans-Peter Fiedler

Journal of Biotechnology 80 (2000) 135–142

Artículo original

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165600002492

Comentario realizado por:

Marina Serrano Maciá

Alicia Serrano Alcalá

María Dolores Olivares Vicente

Patricia Ros Tárraga

Adrián Cabezas Fuster

INTRODUCCIÓN: ESTADO ACTUAL DEL TEMA

La obtención masiva de metabolitos secundarios como antibióticos se necesaria debido al aumento de patógenos resistentes, a la aparición de enfermedades nuevas y a la toxicidad de los compuestos utilizados actualmente. Por lo tanto, se han utilizado varias estrategias para encontrar nuevos fármacos bioactivos y para explotar la producción de los ya conocidos en géneros no tan bien estudiados..

Para ello se ha trabajado con dos géneros estrechamente relacionados: Streptomyces y Streptosporangium. Streptomyces  debido al hecho de que sólo una pequeña parte de su capacidad biosintética se utiliza hoy en día y Streptosporangium (perteneciente al grupo de los actinomicetos raros), debido a que es un género desconocido y por su escasa producción de antibióticos y baja productividad.

HIPÓTESIS DE TRABAJO

¿Es Streptosporangium un candidato para producir metabolitos secundarios de interés bajo las condiciones de fermentación de Streptomyces?

DISEÑO EXPERIMENTAL Y RESULTADOS

Ø  En primer lugar se cultivaron cepas de Streptosporangium partiendo de las condiciones óptimas de Streptomyces en fermentaciones discontinuas:

·         Agitación a 500 rpm

·         Volumen de aireación 1  (volumen gas partido volumen de líquido de trabajo y minuto)

·         Turbina de Rushton

Aquí podemos observar que, manteniendo la presión de oxígeno constante durante el proceso, el crecimiento celular comienza a partir de las 50 horas y, tras 5 días (120h), alcanza la fase estacionaria, donde comienza a producir el metabolito secundario. Finalmente se observa que la concentración final de producto es muy baja.

Ø  En los siguientes experimentos se variaron las condiciones de fermentación para maximizar la productividad, que fueron la velocidad de agitación de 500 a 750 rpm y diferentes volúmenes de aireación.

El pH, la presión de oxígeno y el crecimiento celular se mantienen constantes (por ello no se representan en la gráfica), pero la producción de metabolito secundario experimenta un máximo a 4  y va disminuyendo a valores superiores.

Ø  A continuación se utilizaron diferentes sistemas de agitación (750 rpm, 4  y presión de oxígeno constante).

Aquí podemos observar que se obtiene una mayor producción con la turbina marina que con la turbina Rushton, empleada en los experimentos anteriores. Este resultado se confirma con los dato de la siguiente tabla:

A partir de la tabla se puede apreciar que se consigue 18 veces más de producto al optimizar:

-          Velocidad de agitación

-          Volumen de aireación

-          Sistema de agitación

Ø  A continuación se llevó a cabo un experimento adicional para comprobar si realmente era el oxígeno el gas que influía en la producción de una mayor cantidad  de metabolito secundario (porque los gases en general pueden afectar a la variabilidad del metabolito).

En la gráfica se observa que la mayor producción de metabolito secundario se produce con el mayor suministro de oxígeno.

Ø  Finalmente, se realizó un experimento con una cepa de Streptomyces utilizando las mismas condiciones óptimas de Streptomyces, pero utilizando diferentes volúmenes de aireación.

En la gráfica se observa un máximo de producción a 0.5  (bajas tasas de aireación). 
Se pretenden confirmar las condiciones óptimas de Streptomyces y confirmar que son completamente diferentes a las del género Streptosporangium, pudiéndose observar que Streptomyces tiene producción óptima a bajos volúmenes de aireación; mientras que Streptosporangium la tiene a elevados volúmenes (en este caso fue a 4). 

CONCLUSIÓN

Para mejorar la formación de metabolito secundario es necesaria la optimización de las condiciones de fermentación.

Se demostró que el oxígeno tiene un gran impacto sobre el rendimiento de producción de metabolito secundario variando la velocidad y sistema de agitación y el volumen de aireación que mejoraban su transferencia y suministro hacia las células, por lo que se concluyó que el tamaño de la burbuja influía en la producción de metabolitos secundarios. Además, mediante los experimentos realizados se obtuvieron las condiciones óptimas de Streptosporangium, que eran una velocidad de 750 rpm de agitación, una turbina marina que disminuía el efecto de cizallamiento sobre las células en suspensión y un volumen de aireación de 4 . En estas condiciones se obtiene 18 veces más de producto que utilizando las condiciones iniciales correspondientes a Streptomyces, que son totalmente diferentes, como se demuestra en el último experimento.

            Por otra parte, debido a la optimización de las condiciones de fermentación, se consiguieron aislar nuevos metabolitos secundarios en diversos géneros de Streptomyces.

            El proceso de optimización sirve para aumentar la producción de los metabolitos ya conocidos de ambos géneros y permitir el descubrimiento de nuevos, ya que previamente su producción basal era tan baja que no se podía detectar su presencia.

            Una vez obtenidos se procederá a su estudio para conocer su utilidad, por ejemplo, como fármaco.

Optimización del proceso de obtención de bioetanol a partir de la paja del arroz.

Realizado por Francisco García Asencio, Daniel Carrillo Bautista, Alejandro Pardines Juan, Carla Crespo Quiles y Marina Sánchez Soler

Li et al. Bioethanol production from rice straw by a sequential use of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis with heat inactivation of Saccharomyces cerevisiae cells prior to xylose fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering, (2011), Vol 111, p: 682-686

Introducción: Estado actual del tema a presentar

En la actualidad numerosos centros de investigación están desarrollando métodos para optimizar la producción de bioetanol a partir de la paja del arroz. Esto surge a partir de la necesidad de la sustitución de los combustibles fósiles tradicionales por una fuente de combustible más sostenible.

La producción de bioetanol a partir de la paja del arroz se lleva a cabo por la fermentación alcohólica de la glucosa y la xilosa, azúcares que se obtienen a partir de la hidrólisis de lignocelulosa, presente en la pared celular de las plantas.^[1]

Hasta el momento este proceso se llevaba a cabo a partir de la fermentación conjunta de los monosacáridos nombrados mediante la aplicación simultánea de diversos microorganismos. Sin embargo, al llevar a cabo el proceso salía a la luz un problema: el rendimiento a partir de la xilosa era muy bajo, esto sucede porque existe competencia de los microorganismos por el oxígeno.^[2]

Hipótesis de trabajo

En este proyecto se propone una alternativa a la utilización de microorganismos genéticamente modificados que son una fuente de preocupación social.

Se utilizan los microorganismos Saccharomyces cerevisiae y Picchia Stipitis para la fermentación secuencial de glucosa y xilosa respectivamente. De esta forma solucionaríamos el problema del rendimiento. Además, la hidrólisis de la lignocelulosa se lleva a cabo simultáneamente con la fermentación para reducir el tiempo del proceso, hecho que produce un abaratamiento de los costes.

 Previamente a la inoculación¹ de Picchia Stipitis se han de inactivar las células² de S. cerevisiae para evitar competitividad entre ambos, aumentando así la eficiencia de la obtención de etanol a partir de xilosa y evitando además la acumulación de xilitol como producto no deseado.

Diseño experimental y resultados

La paja de arroz fue previamente tratada para crear un medio de cultivo adecuado para los microorganismos utilizados, P.stipitis y S.cerevisae. Como hemos mencionado anteriormente, es necesario inactivar S.cerevisae para obtener una mejor producción de etanol a partir de la fermentación de la xilosa por P.stipitis. A continuación, exponemos los cuatro experimentos que se desarrollaron con el fin de observar los efectos de la inactivación de S.Cerevisiae:

En el experimento número 1, inactivamos S.cerevisiae manteniéndola a 50ºC durante 6 horas y posteriormente inoculamos P.stipitis.

En el experimento 2, inoculamos P.stipitis al mismo tiempo que en el experimento anterior pero sin la previa inactivación de S.cerevisiae.

En el experimento 3, solo se inoculó S.cerevisiae sin ser inactivada, y posteriormente se añadió agua destilada que sustituiría a P.stipitis.

Por último, en el experimento 4, se realiza la inactivación de S.cerevisiae en las mismas condiciones que en el experimento 1, a 50ºC durante 6 horas, sustituyendo la inoculación de P.stipitis por agua destilada

Gráficas concentración/tiempo de glucosa, xilosa, etanol y xilitol en los 4 distintos experimentos:

Experimento 1: se observa en la gráfica que la concentración de xilosa desciende más rápidamente que en el resto de experimentos, debido a que S. cerevisiae ha sido inactivada, por lo que no establecerá competencia con P. stipitis, pudiendo ésta así sintetizar etanol de un modo más eficiente (obtenemos mayor concentración de etanol), disminuyendo la concentración de xilosa más rápidamente.

Experimento 2: se observa que la concentración de xilitol es mayor que en el resto de experimentos, debido principalmente a que la enzima que degrada este compuesto, la xilitol deshidrogenasa, funciona con oxígeno. Por consiguiente, la acción de esta enzima será menor, al tener menos oxígeno, ya que S. cerevisiae no ha sido inactivada.

Experimento 3: al no inocular P. stipitis, se observa como casi no disminuye la concentración de xilosa.

Experimento 4: se observa que la  concentración de glucosa y xilosa aumentan en el tiempo, ya que no hay nadie que las degrade. Sin embargo, cuando se ha inactivado S. cerevisiae, no hemos eliminado toda la población, una pequeña fracción sobrevive, por lo que pasado un tiempo esta población provocará la disminución en la concentración de glucosa. Contrariamente, la concentración de xilitol será muy baja, ya que no habrá ningún microorganismo que degrade la xilosa.

Fermentación de la glucosa y de la xilosa mediante S.cerevisiae y P. stipitis

En vista de los resultados anteriores se decidió llevar la investigación por el camino del primer experimento, repitiendo éste, pero en un fermentador de mayor tamaño.

Se utilizó un  medio sintético (compuesto por 50,4 g/l de glucosa, y 20,7 g/l de xilosa) para comprobar el efecto de inactivación de S. cerevisiae en la fermentación de la xilosa mediante P.stipitis. En primer lugar, se inoculó S.cerevisae en condiciones anaeróbicas a 30ºC durante 8 horas para que se produzca la fermentación de la glucosa. A continuación, se somete a las células a 50ºC durante 6 horas con el fin de inactivarlas. Una vez inactivadas se enfría el medio hasta 30ºC y se inocula la P.stipitis. Por último, se produjo la fermentación de la xilosa realizada por P.stipitis a 30ºC. Periódicamente se tomaron muestras para analizar la concentración de levaduras, azúcares, etanol y otros compuestos (como se muestra en la fig. 2).

Conclusión

Por la inactivación de las células S. cerevisiae antes de la inoculación del P. stipitis, se produjo un 23.0% más de etanol así como un 42.4% menos de xilitol. Al mismo tiempo, casi toda la xilosa (95.8%) fue fermentada. Por lo tanto los resultados de esta investigación indicaron que simplemente inactivando S. cerevisiae, la fermentación de la xilosa podría mejorarse considerablemente y el tiempo de fermentación podría reducirse también notablemente. Tras la inactivación de las células de S.cerevisiae se obtuvo un incremento en la producción de etanol, alcanzando 31 g/L de etanol en 36 horas (resultado que iguala en un 84% las producciones teóricas).

[1]: http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2009_3/Lignocelulosa.pdf

[2]: Importancia del oxígeno: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC184958/pdf/aem00092-0167.pdf

       Competencia: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/014102299190067K

1: Inocular: Introducción de las células en el medio.

2: Inactivar las células: reducir su número hasta que su presencia  sea insignificante