Las bacteriocinas son unas toxinas proteicas sintetizadas por ribosomas de las bacterias del ácido láctico capaces de inhibir el crecimiento de bacterias similares o cepas cercanas. Se utilizan en los alimentos como conservantes biológicos y actualmente son candidatos a producir medicamentos. Como bioconservantes, pueden añadirse a los alimentos siguiendo tres estrategias diferentes: in situ, directamente en una forma purificada o semipurificada y, como producto a partir de la fermentación de una cepa productora de bacteriocinas. Un ejemplo de bacteriocina es pediocina PA-1.
El uso industrial de las bacteriocinas requiere procesos eficientes, pero la baja tasa de producción puede afectar la aplicación de bacteriocinas. Para paliar esto, se han diseñado dos posibles soluciones:
-La expresión heteróloga es una estrategia eficaz para mejorar los rendimientos de la producción de bacteriocina. Se uilizó Lactococcus lactis para producir bacteriocinas como la PA-1, y podría ser utilizada como huésped para la producción a gran escala. Además, debido a su estado estable y seguro, L. lactis es una bacteria interesante para la administración in vivo de bacteriocinas con fines probióticos o para alimentos fermentados.
-Mejorar la etapa de secreción y por lo tanto la productividad global, es reemplazar el péptido señal de tipo silvestre del recombinante por el péptido señal Usp45 (SPusp45), permitiendo así la secreción de la pediocina PA-1. El estudio de la producción de proteínas recombinantes en L. lactis mostró que la inserción del péptido LEISSTCDA (o propéptido SD) entre el péptido señal y la proteína recombinante NucB, permitió aumentar la producción de NucB.
La pediocina PA-1 es un modelo de bacteriocina de clase IIa (que son bacteriocinas producidas por las bacterias de ácido láctico), producido por diversas cepas de Pediococcus y Lactobacillus. Esta bacteriocina muestra actividad antibacteriana frente a un gran espectro de patógenos que producen infecciones alimentarias y bacterias Gram positivas capaces de producir el deterioro de los alimentos. Afectan tanto a la permeabilidad de la membrana como al potencial. La pediocina PA-1 madura consiste en un péptido de 44 aminoácidos que contiene cuatro residuos de cisteínas enlazados en dos puentes disulfuro.
El objetivo de este proyecto fue investigar la eficiencia de una producción heteróloga (producción de proteínas recombinantes) de pediocina en Lactococus lactis a los niveles cuantitativos y cualitativos con un enfoque especial en la secreción de la proteína y la modificación post-traduccional.
Experimento
Para llevar a cabo el experimento, se diseñaron 3 plásmidos con el objetivo de producir tres pediocinas recombinantes diferentes. Estos plásmidos dirigían la secreción de las pediocina PA-1 recombinantes fusionadas, y que presentarían el péptido SD y LEISSTCDA en el N-terminal respectivamente. Los tres plásmidos fueron usados para transformar L. lactis. Las cepas resultantes fueron cultivadas con el objetivo de producir las pediocinas recombinantes.
Observando el producto de cada cepa, se llegó a la conclusión de que todas producían aproximadamente la misma cantidad de biomasa. La concentración de cada pediocina recombinante fue medida mediante el método ELISA.
Tras algunas determinaciones, se observó que la producción específica de pediocina por L. lactis es aproximadamente 20 veces más eficiente que la producción de pediocina del fenotipo silvestre.
Los resultados muestran así que los propéptidos (proteína inmadura) SD y LEISSTCDA permiten un aumento de 1,5 veces la producción de pediocinas recombinantes secretadas.
A continuación, se evaluó la actividad antibacteriana de los sobrenadantes mediante ensayo de difusión de pocillo de agar utilizando Carnobacterium maltaromaticum como cepa diana. Se obtuvieron áreas de inhibición a partir de los sobrenadantes de cultivo de las tres cepas L. lactis pero no se obtuvo inhibición con el cultivo sobrenatural de la cepa de control.
La potencia de las pediocinas recombinantes producidas en L. lactis se comparó con la pediocina de tipo silvestre producida por Pediococcus acidilactici. Sorprendentemente, la pediocina de tipo silvestre PA-1 producida a partir de P. acidilactici exhibió un valor 30 veces más activo que las pediocinas recombinantes.
Este resultado sugiere que la estructura de las pediocinas recombinantes es diferente de la pediocina de tipo silvestre. Aunque se describe que las bacteriocinas de clase IIa no están modificadas postraduccionalmente, todas exhiben al menos un enlace disulfuro. Se conoce que los enlaces disulfuro son importantes para la actividad antibacteriana de la pediocina PA-1. Por ello, se planteó la hipótesis de que existen enzimas que podrían permitir la formación correcta de enlaces disulfuro en productores de bacterias PA-1 de pediocina de tipo silvestre. Los últimos estudios han demostrado que las tiol-disulfuro oxidorreductasas (TDOR) están implicadas en la maduración postraduccional de las bacteriocinas.
El análisis de secuencias de la pediocina PA-1 reveló que pedC codifica una supuesta proteína que es secretada. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis de que PedC es un TDOR y permite la formación de enlaces disulfuro nativos de la pediocina PA-1. Por lo tanto, se llevó a cabo un experimento de inhibición con cepas transformadas con PedC con el fin de comprobar si este propéptido mejoraba la producción de la pediocina.
La secuencia de codificación de pedC se clonó y el plásmido resultante se usó para transformar L. lactis. Paralelamente, la misma cepa receptora se transformó, y la resultante se usó como control. Los ensayos de inhibición dieron lugar a halos de inhibición del crecimiento más amplios para la cepa transformada (A y C) con pedC que para la cepa control (B y D). Usando como cepa receptora Carnobacterium maltaromaticum y añadiendo al centro las cepas de L. lactis.
Estos resultados muestran que, incluso si se producen cantidades menores de pediocina recombinante, se obtiene una actividad más alta con la cepa coproduciendo la pediocina recombinante y PedC. Además, PedC permite aumentar la potencia antibacteriana de la pediocina recombinante en L. lactis.
Discusión de las diferentes hipótesis
Los propéptidos SD y LEISSTCDA no tuvieron ningún impacto significante en la actividad específica antibacteriana de la pediocina PA-1. Añadiendo residuos de aminoácidos al N-terminal de las bacteriocinas de clase IIa se pueden tener varios impactos en la potencia y en la ingeniería de péptidos. Esto implica que fusiones de péptidos en el N-terminal requerirán comprobar el impacto en la potencia antibacteriana de las bacteriocinas que se parecen a la pediocina.
Se mostró que todas las pediocinas recombinantes eran menos activas que la pediocina PA-1 silvestre producida por P. acidilactici. Se hicieron hipótesis sobre si las bacterias recombinantes deben estar sujetas a autosegregación o degradación. Otra hipótesis puede estar ligada al hecho de que la pediocina PA-1 tiene dos enlaces disulfuro. El enlace disulfuro del N-terminal se conserva en las bacteriocinas de la clase IIa, mientras que el enlace disulfuro C-terminal está menos conservado y es importante tanto para el espectro de pediocina PA-1 como para la estabilidad de dentro de la membrana bacteriana. Cuando la producción heteróloga de la pediocina PA-1 se lleva a cabo usando Lactobacillus sakei, se forman enlaces disulfuro no nativos. Se hipotetizó que se formaba cisteína similar por error en la pediocina PA-1 producida en L.lactis.
El análisis secuencial del operón reveló que pedC podría codificar una proteína con un posible papel en el estado de los enlaces disulfuro de la pediocina PA-1. En el estudio, la coproducción de PedC y la proteína recombinante permitieron la producción de una bacteriocina con una mayor potencia. Aunque PedC se describe como una proteína accesoria de transporte, se concluyó que era esencial para la secreción tanto en Pediococci como en E. coli. Sin embargo, como la cantidad de PA-1 producida no fue medida, aún no está claro si la ausencia de actividad detectada en este estudio fue debida a la disminución de la eficiencia de secreción y/o a la potencia.
Otro estudio demostró que PedC fue suficiente para permitir la segregación de pediocina PA-1 en E.coli. Los resultados apoyaron que PedC aumentaba la potencia de pediocina PA-1. Los análisis secuenciales mostraron que los genes homólogos pedC están genéticamente ligados a genes que codifican la bacteriocina sugiriendo que TDORs eran funciones críticas para estas bacteriocinas. Otros dos estudios revelaron el papel de TDORs en la potencia de bacteriocinas pertenecientes a otras clases.
Conclusión
Este estudio reveló que el modelo de la pediocina PA-1 de la clase IIa de las bacteriocinas es lo suficientemente flexible como para tolerar fusiones por el extremo N-terminal. Esta propiedad fue usada aquí para mejorar la secreción eficiente y para poder ser también usada para otros propósitos como ingeniería genética de innovar compuestos antibacterianos. Este trabajo reveló que la sola expresión del gen estructural de la clase IIa de pediocina PA-1 en un hospedador heterólogo, podría no ser suficiente para obtener una actividad antibacteriana óptima. También se observó que PedC podría ser de utilidad para mejorar la actividad de bacteriocinas recombinantes, probablemente por el aumento de la concentración de enlaces disulfuro correctos que contienen los péptidos (su función silvestre es la formación de puentes disulfuro en PA-1).
Artículo: Microbial Biotechnology: Recombinant pediocin in Lactococcus lactis: increased production by propeptide fusion and improved potency by co-production with Ped.
Autores: John Wiley & Sons Ltd.
Trabajo realizado por:
Gema Beltrán Moya, Javier Fernández Fernández, Marina Jiménez Martínez, Miguel Ángel Pertusa Barberá y Daniela Martínez González
