Nuevas milbemicinas obtenidas a partir del mutante Streptomyces bingchenggensis X-4

Streptomyces bingchenggensis es una bacteria gram positiva de la clase actinobacterias, perteneciente al  género Streptomyces, responsable de procesos fermentativos de materia orgánica y de la producción de milbemicinas, antibióticos macrólidos (destacados en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias intracelulares) de 16 miembros con una actividad excepcional contra diversos tipos de ácaros. Los tipos conocidos de milbemicinas son alfa1 (A3), alfa3 (A4), beta14, beta28, beta29, alfa30 y ST 906, cuatro secomilbemicinas A, B, C y D, y dos milbemicinas pentapeptídicas. Para la elevada producción de los productos A3 y A4 se obtuvo una estirpe mutante fenotípicamente diferente a Streptomyces bingchenggensis, denominada S. bingchenggensis X-4, mediante procesos de tratamiento con rayos UV, N-metil-N-nitroso-N-nitrosoguanidina (agente químico mutagénico) y técnicas de manipulación genética.  Mientras se estaba realizando la investigación de los metabolitos producidos por esta nueva cepa, aparecieron tres nuevos compuestos bastante interesantes: la milbemicina beta15 (1), secomilbemicinas E (2) y F (3) los cuales se aislaron del caldo de fermentación de S. bingchenggensis X-4. La estructura del  compuesto 1 es similar a la milbemicina D, compuesto que  se usa como plaguicida contra nematodos (una especie de gusanos) parasitarios de las plantas, además es muy selectivo y bastante potente, por lo que la bioactividad del compuesto 1 debe de investigarse más.   Respecto a las secomilbemicinas previamente descubiertas, los grupos hidroxilo (OH) en el carbono situados en la posición 5,  no se encontraban en los compuestos 2 y 3. Otro dato importante es que las milbemicinas y avermectinas obtenidas a partir de microorganismos, contienen ese grupo hidroxilo en C-5 y los derivados de estas solo se pueden obtener mediante métodos sintéticos, por lo que estos dos nuevos compuestos, que no presentan ese grupo hidroxilo característico en el carbono 5, pueden tener un papel importante en la compresión y el perfeccionamiento de las vías de biosíntesis de milbemicinas.

Para la obtención de estos compuestos se llevo a cabo una sería de procesos. En primer lugar, la cepa mutante se mantuvo en un agar inclinado, que proporciona  un medio selectivo de bajo pH útil para cultivar organismos acidotolerantes (capaces de vivir y tolerar un pH acido) y acidófilos (crecimiento óptimo en pH de 1 a 5),  a una temperatura de 28ºC durante 12 días. Luego, este medio de cultivo se traslada a un matraz en un reactor rotatorio a 250 rpm (revoluciones por minuto) durante 30 horas a 28°C. Una vez finalizado este periodo de tiempo, se inocula con 0,5 L (provenientes del matraz) un fermentador con 10 L de medio de siembra y con  una capacidad máxima  de 15 L. En este fermentador se  incuba durante 32 horas con una aireación y agitación de 1VVM (vvm = volúmenes de aire por unidad de volumen de medio por minuto) y a 180 rpm.

Después de dicha incubación, se transfirieron 3 L de este fermentador de 15 L a otro fermentador de producción con  30 L de medio de cultivo y una capacidad máxima de 50 L. En este fermentador se mantuvo a 28 ºC, con un pH inicial de 7.4 y se esterilizó por burbujeo de vapor (mediante un sparger, que es el instrumento utilizado para suministrar vapor a presión al interior del fermentador) a 121ºC durante 30 min. Una vez esterilizado, se realizó la fermentación durante 10 días a 28 ºC. En todo el proceso siempre  se garantizó unas condiciones apropiadas para favorecer el proceso fermentativo.

  Sparger, instrumento utilizado para suministrar vapor a presión al fermentador. Se trata de una especia de tubo perforado conectado un pistón, de tal manera que el movimiento horizontal de dicho pistón provoca la entrada de vapor a presión en el interior del fermentador

Tras la incubación durante 10 días, el caldo de fermentación (33 L) se filtró. La torta (los restos obtenidos tras la filtración) resultante fue lavada con agua, y ambos, el  filtrado y el lavado, se descartaron, ya que lo único que  interesa es la torta, donde se encuentra los productos de interés. El metanol (10 L) se utilizó para extraer la torta lavada. Alrededor de 2 L del extracto de metanol (MeOH) fueron evaporados a presión reducida y a 45 ºC , y el concentrado resultante se extrajo tres veces usando un mismo volumen de EtOAc (etanoato de etilo). Posteriormente,  la fase de EtOAc combinada se concentró bajo presión para rendir 30 g de sustancias oleosas, con las que se realizó una cromatografía sobre un gel de sílice. Después se eluyó con petróleo y éter-acetona y se obtuvieron dos fracciones, la fracción I y II. A la fracción I se le sometió a una columna de Sephadex LH-20 (lecho usado para algunos tipos de cromatografía por donde pasan o no las muestras a estudiar) en gel,  eluyendo con MeOH para así tener la subfracción I, la cual se depuró a partir de una HPLC (cromatografía liquida de altaeficacia) para así obtener un compuesto puro a temperatura ambiente.

En la fracción II se procedió de la misma manera, es decir, se realizó una cromatografía en columna de Sephadex LH-20 eluyendo también con MeOH para obtener así la subfracción II. Esta se purificó con una HPLC semipreparativa  utilizando un disolvente (contiene una mezcla de CH₃OH-CH₃CN-H₂O) para obtener así un compuesto puro a temperatura ambiente, en este caso la milbemicina β₁₅.

Una vez que se realizó la purificación y concentración de los compuestos, el compuesto 1 se aisló como un aceite incoloro con UV y se estableció su fórmula molecular, siendo esta C₃₃H₅₀O₇ que se deduce mediante una ionización de alta resolución por electrospray (HRESI)

También se realizó una RMN (resonancia magnética nuclear) para descubrir la estructura de cada compuesto, y esta técnica consiste en aplicar un campo magnético externo que va a provocar que los núcleos de los átomos a analizar se orienten en la misma dirección que el campo magnético externo. La radiofrecuencia utilizada para excitar estos núcleos nos va a dar un espectro de emisión de estos núcleos, que liberarán esta energía cuando se deje de inducir el pulso de radiofrecuencia y los núcleos reorienten su campo magnético local a su posición inicial.

  Estructura de la milbemicina β15 obtenida por RMN 

De esta forma se ha logrado extraer milbemicinas por procesos fermentativos de una estirpe mutante de Streptomyces bingchenggensis, que han adquirido una gran importancia biotecnológica  ya que, actualmente,  se utilizan como acaricidas frente a ácaros adultos de Tetranychus urticae y como nematocida contra Caenorhabditis elegans.

Integrantes del grupo:

Ricardo Requena Platek

Guillermo del Barco Aldaz

Manuel Garrido Romero

Rubén Mollá Albaladejo

Joan Sánchez Pascual

Referencias bibliográficas:

"New milbemycins from mutant Streptomyces bingchenggensis X-4"

The Journal of Antibiotics (2011) 64, 753–756; published online 17 August 2011

Bao-Xin Zhang, Hui Zhang, Xiang-Jing Wang, Ji-Dong Wang, Chong-Xi Liu and Wen-Sheng Xiang

http://www.nature.com/ja/journal/v64/n11/full/ja201175a.html

“Effect of fermentation temperature on validamycin A production by Streptomyces hygroscopicus 5008”

Efecto de la temperatura de fermentación en la producción de Validamicina A por Streptomyces hygroscopicus 5008.

Artículo:  “Effect of fermentation temperature on validamycin A production by Streptomyces hygroscopicus 5008”
Publicado en la revista: Journal of Biotechnology número 142 del año 2009 (páginas 271- 274).
Autores: Yueqiao Liao, Zhen-Hua Wei, Linquan Bai, Zixin Deng, Jian- Jiang Zhong.

1.       INTRODUCCIÓN

En el este de Asia, existe una enfermedad en el cultivo de arroz llamado “tizón de la vaina” producido por un hongo. La validamicina A (VAL-A), producida por Streptomyces hygroscopicus es un importante agroantibiótico antifúngico. En este trabajo, el efecto de la temperatura de fermentación en la biosíntesis de VAL-A fue investigada entre 28˚C-42˚C, se concluyó que un rango interesante de temperaturas para esta producción se encuentra entre 35˚C-37˚C. Los tres operones, valABC, valKLMN y valG, para los ocho genes necesarios para la producción de validamicina A, fueron activados cuando la temperatura alcanzaba el umbral. La actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) de la ruta de las pentosas fosfato y ValG de la biosíntesis de Val-A fueron también mejoradas a una alta temperatura de cultivo.

La enfermedad  tizón de la vaina de arroz presenta la sintomatología hacia finales del ciclo del cultivo. Se produce el marchitamiento y secado de hojas quedando adheridas al tallo. Cuando el cultivo ya se encuentra senescente, se hace visible el signo del patógeno, representado por hileras de puntos negros sobre el tallo, que son los cuerpos de fructificación del hongo.

Rhizoctonia solani, el hongo causante de la enfermedad, puede sobrevivir en el suelo durante muchos años en forma de esclerocios. Los esclerocios de Rhizoctonia tienen gruesas capas externas que permiten la supervivencia y funcionan como la estructura de hibernación del patógeno. En algunos casos raros el patógeno también puede tomar la forma de micelio que reside en el suelo. El hongo es atraído a la planta por estímulos químicos liberados por la planta en crecimiento y/o el residuo de descomposición de la planta.

El proceso de penetración en un huésped se puede lograr de diferentes maneras. La entrada puede ocurrir a través de la penetración directa en la cutícula de la planta/epidermis o por medio de aberturas naturales en la planta. Las hifas entrarán en contacto con la planta y se unirán por medio del crecimiento, penetrando en la célula de la planta permitiendo al patógeno obtener los nutrientes.  El patógeno también puede liberar enzimas que descomponen las paredes celulares de la planta, y continúa para colonizar y crecer dentro del tejido muerto. Esta ruptura de las paredes celulares y la colonización del patógeno en el huésped es lo que forma el esclerocio. Un nuevo inóculo se produce en o dentro del tejido huésped, y un nuevo ciclo se repite cuando se dispone de nuevas plantas.

El ciclo de la enfermedad comienza  durante el invierno. El esclerocio/micelio se encuentra en los restos en descomposición de plantas, en el suelo o en plantas huéspedes.  Las hifas jóvenes y basidios en fructificación  emergen y producen micelio y basidiosporas.  La producción de basidiosporas en germinación penetran en el estoma mientras que el micelio se sitúa sobre la superficie de la planta y secreta las enzimas necesarias en la planta con el fin de iniciar la invasión de la planta huésped. Después de invadir con éxito al huésped, se forma necrosis y esclerocios en y alrededor del tejido infectado que entonces conduce a los diversos síntomas asociados con la enfermedad, tales como la pudrición del suelo y del tallo… y el proceso comienza de nuevo.

Validacin es un efectivo fungicida-bactericida de origen natural, cuyo ingrediente activo es la validamicina A, producida por Streptomyces hygroscopicus 5008. Inhibe la trehalasa,  una enzima presente en la mayoría de los seres vivos, pero que es inhibida con mayor efectividad en hongos. Esta inhibición bloquea la reacción que oxida la trehalosa en dos glucosas. Esto  afecta a la digestión y al transporte de glucosa a las puntas de las hifas, deteniendo su crecimiento, por tanto el micelio no puede afectar a la planta. Por un lado, al no producir glucosa se acumula la trehalosa, provocando el hinchamiento de las células por un efecto higroscópico (capacidad de algunas sustancias de absorber o ceder humedad al medio ambiente). Por otro lado, al no producirse glucosa, no se puede producir una sustancia que forma parte de la membrana (fosfatioinositol), con lo que ésta queda afectada y detiene el crecimiento de las puntas de las hifas.

2.       MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo y análisis de fermentación

Las esporas de S. hygroscopicus 5008 fueron almacenadas, activadas y cultivadas para luego ser recogidas en seis duplicados, uno para cada condición de temperatura.

Para determinar la concentración de proteína intracelular, se centrifugó el micelio, se lavó y luego se distribuyó a dos tubos Eppendorf, añadiendo lisozima a uno de los tubos para la lisis de las células. El método estándar de Bradford se utilizó para determinar la proteína liberada por el micelio, utilizando el colorante azul de Coomasie G-250 se puede observar que todas aquellas proteínas existentes en la muestra se tiñen de color azul. Para poder utilizar este método se requiere realizar una curva de calibración o curva estándar, con soluciones de proteínas de concentración conocida, a las cuales se les mide la absorbancia en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 595 nm para luego finalmente poder cuantificarlas. Los residuos de azúcar se determinaron por el método colorimétrico fenol-sulfúrico, que gracias a la reacción que produce azúcares simples, fenol y ácido sulfúrico se obtiene como resultado un color amarillo, naranja. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de carbohidratos presente por lo que se puede cuantificar los azúcares midiendo la absorbancia. Y finalmente la cantidad de VAL-A producida se midió por HPLC; con esta técnica se consigue separar los componentes de una mezcla ya que se basa en los diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias a analizar y la columna cromatográfica.

RNA y análisis de RT-PCR cuantitativa

Los niveles de transcripción de los genes valABC, valKLMN y valG fueron determinados por RT-PCR cuantitativa que corresponde a una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.

Se utiliza para ello los Eppendorf Mastercycler Realplex con One Step PrimeScript-RT-PCR Kit. Las reacciones de control fueron fijadas mediante la adición de RNA sin transcripción inversa en lugar de cDNA. Después de pre-desnaturalizar a 95°C durante 5 min, la amplificación se va a producir en dos pasos: 15 s 95°C para desnaturalizar y 30 s a 60°C para el alineamiento y la elongación y todo este proceso durante 40 ciclos.

Determinación de actividades enzimáticas de ValG

La actividad ValG se analizó de la siguiente manera: La mezcla de reacción (100 µl) con 25 mM Tris–HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 20 mM NH₄Cl, UDP-glucosa de 15 mM, 10 mM validoxylamine A y 2µl de la solución de enzima fue incubada durante 3 h a 30°C, 35°C, 37°C y 42°C, respectivamente, en consonancia con su temperatura de fermentación. Posteriormente, se añadieron 100 µl de cloroformo para detener la reacción y la proteína fue retirada. La actividad enzimática se determinó midiendo la cantidad de VAL-A transformada a partir de validoxylamine por HPLC. La concentración de la proteína de la solución de enzima se determinó por el método estándar de Bradford.

3.       RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como es bien sabido, la síntesis de las proteínas está directamente relacionada con la regulación y expresión de los genes responsables de su producción y la actividad enzimática de las reacciones que la llevan a cabo.

Por ello, el experimento se realizó a tres niveles (cinética de la síntesis proteica, expresión génica y actividad enzimática) relacionados con la producción de validamicina A.

Velocidad de producción

Además de estudiar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de acumulación de la validamicina A, también observaron que la temperatura afectaba a otros factores, como la producción de proteínas intracelulares o el pH.

Proteínas intracelulares

Observaron que en la etapa inicial (hasta 16 horas), la velocidad de acumulación de proteínas intracelulares era mayor a altas temperaturas (37⁰C a 42⁰C). Sin embargo, en la etapa intermedia (hasta 48 horas), la velocidad de síntesis era  mayor a temperaturas inferiores (entre 28⁰C y 35⁰C). Finalmente, en la etapa tardía (hasta 120 horas), la producción a altas temperaturas disminuía considerablemente.

Los resultados que obtuvieron se muestran en la siguiente gráfica:

 Validamicina A

Al igual que en las demás proteínas, en la etapa inicial se observó un aumento de la velocidad de producción a temperaturas altas, sin embargo, este aumento era visible también en la etapa intermedia. En la etapa tardía, la velocidad disminuía a altas temperaturas.

Es destacable la diferencia en las velocidades a las temperaturas de 35⁰C y 37⁰C, lo que conllevó a definir que la temperatura umbral para incrementar considerablemente la producción era la de  37⁰C.

Variación del pH

Una temperatura alta durante la etapa inicial también causa efectos sobre el pH, aumentándolo.

Expresión génica

Para estudiar la expresión de los genes relacionados con la síntesis de Val-A (valABC, valKLMN y valG) se disgregaron las células de Streptomyces hygroscopicus y se purificó su ARN con el método del Trizol y eliminando el ADN con la DNasa I. A partir de este ARN se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa a tiempo real para determinar el grado de expresión de los genes nombrados.

Se observó un aumento en el grado de expresión de estos genes al elevar la temperatura de 35⁰C a 37⁰C en las etapas inicial e intermedia, coincidiendo con el aumento en la producción de validamicina A.

Además la elevada expresión de valABC  y valKLMN  en la etapa inicial a 42⁰C concuerda con una mayor producción del agente antifúngico.

Actividad enzimática

Hay que tener en cuenta que la temperatura tiene un papel importante no sólo a nivel transcripcional, sino también a nivel post-transcripcional. Por ello, se estudió la actividad de dos enzimas: la G6PDH, por su importante función en la ruta de las pentosas fosfato, y la valG, por participar en la última etapa de síntesis de la validamicina A.

En cuanto a la G6PDH, en la ruta de las pentosas fosfato produce un precursor para la biosíntesis del antibiótico, la sedoheptulosa 7-fosfato (S7P). Una elevada temperatura en la etapa inicial aumenta la actividad de la G6PDH y, sin embargo, en la etapa siguiente produce una disminución de la misma. En la etapa tardía apenas se detecta actividad.

Por otro lado, un incremento en la temperatura aumenta la actividad de valG en la etapa inicial, pero hay que tener en cuenta que, en la etapa intermedia el aumento sigue, excepto cuando la temperatura alcanza  los 42⁰C.

4.       CONCLUSIÓN

El incremento de temperatura aumenta la actividad de los genes implicados en la síntesis de Val-A, la actividad de G6PDH (y la ruta PP) y de valG. Todo ello conlleva a una mayor producción de validamicina A.

En conclusión, conociendo la ruta de biosíntesis de la validamicina A (o de cualquier otro compuesto) y los factores que la afectan, se pueden modular para incrementar la producción.

Componentes del grupo: Beatriz García Alonso, Adela Bernabeu Zornoza, Carla Navarro Quiles, Magdalena Nikolaeva Koleva y María Poveda Deltell.

Mejora de la producción de metabolitos secundarios en Streptosporangium

Improved secondary metabolite production in the genus
Streptosporangium by optimization of the fermentation
conditions

Christoph Pfefferle, Uwe Theobald, Hanne Gürtler, Hans-Peter Fiedler

Journal of Biotechnology 80 (2000) 135–142

Artículo original

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165600002492

Comentario realizado por:

Marina Serrano Maciá

Alicia Serrano Alcalá

María Dolores Olivares Vicente

Patricia Ros Tárraga

Adrián Cabezas Fuster

INTRODUCCIÓN: ESTADO ACTUAL DEL TEMA

La obtención masiva de metabolitos secundarios como antibióticos se necesaria debido al aumento de patógenos resistentes, a la aparición de enfermedades nuevas y a la toxicidad de los compuestos utilizados actualmente. Por lo tanto, se han utilizado varias estrategias para encontrar nuevos fármacos bioactivos y para explotar la producción de los ya conocidos en géneros no tan bien estudiados..

Para ello se ha trabajado con dos géneros estrechamente relacionados: Streptomyces y Streptosporangium. Streptomyces  debido al hecho de que sólo una pequeña parte de su capacidad biosintética se utiliza hoy en día y Streptosporangium (perteneciente al grupo de los actinomicetos raros), debido a que es un género desconocido y por su escasa producción de antibióticos y baja productividad.

HIPÓTESIS DE TRABAJO

¿Es Streptosporangium un candidato para producir metabolitos secundarios de interés bajo las condiciones de fermentación de Streptomyces?

DISEÑO EXPERIMENTAL Y RESULTADOS

Ø  En primer lugar se cultivaron cepas de Streptosporangium partiendo de las condiciones óptimas de Streptomyces en fermentaciones discontinuas:

·         Agitación a 500 rpm

·         Volumen de aireación 1  (volumen gas partido volumen de líquido de trabajo y minuto)

·         Turbina de Rushton

Aquí podemos observar que, manteniendo la presión de oxígeno constante durante el proceso, el crecimiento celular comienza a partir de las 50 horas y, tras 5 días (120h), alcanza la fase estacionaria, donde comienza a producir el metabolito secundario. Finalmente se observa que la concentración final de producto es muy baja.

Ø  En los siguientes experimentos se variaron las condiciones de fermentación para maximizar la productividad, que fueron la velocidad de agitación de 500 a 750 rpm y diferentes volúmenes de aireación.

El pH, la presión de oxígeno y el crecimiento celular se mantienen constantes (por ello no se representan en la gráfica), pero la producción de metabolito secundario experimenta un máximo a 4  y va disminuyendo a valores superiores.

Ø  A continuación se utilizaron diferentes sistemas de agitación (750 rpm, 4  y presión de oxígeno constante).

Aquí podemos observar que se obtiene una mayor producción con la turbina marina que con la turbina Rushton, empleada en los experimentos anteriores. Este resultado se confirma con los dato de la siguiente tabla:

A partir de la tabla se puede apreciar que se consigue 18 veces más de producto al optimizar:

-          Velocidad de agitación

-          Volumen de aireación

-          Sistema de agitación

Ø  A continuación se llevó a cabo un experimento adicional para comprobar si realmente era el oxígeno el gas que influía en la producción de una mayor cantidad  de metabolito secundario (porque los gases en general pueden afectar a la variabilidad del metabolito).

En la gráfica se observa que la mayor producción de metabolito secundario se produce con el mayor suministro de oxígeno.

Ø  Finalmente, se realizó un experimento con una cepa de Streptomyces utilizando las mismas condiciones óptimas de Streptomyces, pero utilizando diferentes volúmenes de aireación.

En la gráfica se observa un máximo de producción a 0.5  (bajas tasas de aireación). 
Se pretenden confirmar las condiciones óptimas de Streptomyces y confirmar que son completamente diferentes a las del género Streptosporangium, pudiéndose observar que Streptomyces tiene producción óptima a bajos volúmenes de aireación; mientras que Streptosporangium la tiene a elevados volúmenes (en este caso fue a 4). 

CONCLUSIÓN

Para mejorar la formación de metabolito secundario es necesaria la optimización de las condiciones de fermentación.

Se demostró que el oxígeno tiene un gran impacto sobre el rendimiento de producción de metabolito secundario variando la velocidad y sistema de agitación y el volumen de aireación que mejoraban su transferencia y suministro hacia las células, por lo que se concluyó que el tamaño de la burbuja influía en la producción de metabolitos secundarios. Además, mediante los experimentos realizados se obtuvieron las condiciones óptimas de Streptosporangium, que eran una velocidad de 750 rpm de agitación, una turbina marina que disminuía el efecto de cizallamiento sobre las células en suspensión y un volumen de aireación de 4 . En estas condiciones se obtiene 18 veces más de producto que utilizando las condiciones iniciales correspondientes a Streptomyces, que son totalmente diferentes, como se demuestra en el último experimento.

            Por otra parte, debido a la optimización de las condiciones de fermentación, se consiguieron aislar nuevos metabolitos secundarios en diversos géneros de Streptomyces.

            El proceso de optimización sirve para aumentar la producción de los metabolitos ya conocidos de ambos géneros y permitir el descubrimiento de nuevos, ya que previamente su producción basal era tan baja que no se podía detectar su presencia.

            Una vez obtenidos se procederá a su estudio para conocer su utilidad, por ejemplo, como fármaco.