Levaduras y producción de nanopartículas.

          La nanotecnología es una ciencia que engloba muchos aspectos de diversas ramas del conocimiento (física, química, biología, etc.). Tiene como objetivo principal el estudio y la síntesis de nanopartículas. Éstas no son más que versiones de los distintos materiales que se utilizan diariamente en muchas industrias e incluso en la vida cotidiana, pero caracterizados por tener tamaños de 1 a 100 nm (1 millón de veces más pequeños que un milímetro). Además poseen propiedades únicas que las diferencian de las que poseen sus análogos a gran escala. Estas propiedades eléctricas, químicas, ópticas, físicas, etc. han hecho que estos materiales sean de vital importancia en diferentes campos como la industria en general, la electrónica, la óptica, e incluso la agricultura, el medio ambiente y la medicina.

En los orígenes de esta ciencia (no hace más de 50 años) se centraban en métodos físico-químicos de síntesis de estos nanomateriales. Actualmente, las investigaciones se centran en la utilidad y aplicaciones de estos compuestos, encontrándose con el inconveniente de que los subproductos del proceso de síntesis clásica dan lugar problemas medioambientales por su toxicidad, limitando mucho sus usos. Sobre todo los clínicos. En este sentido, los investigadores se han visto impulsados a buscar nuevas vías de síntesis más respetuosas con el medio ambiente y que sean económicamente factibles, encontrando en el uso de microorganismos (bacterias, hongos y levaduras) una solución casi perfecta. La síntesis biológica no produce residuos de alta toxicidad y su escalado a nivel industrial podría ser, no solo económicamente factible, sino que muy beneficioso “matando así dos pájaros de un tiro” (1).

A. Distintas nanopartículas B. Uso de nanopartículas como sondas para cancer (2)

Tras años de investigación se pueden encontrar diversos microorganismos que se encargan de la síntesis de nanopartículas inorgánicas como por ejemplo de plata, de oro, de sulfuro de plomo (PbS), etc. Entre todos estos podríamos destacar el sulfuro de cinc (ZnS), cuyas nanopartículas son ampliamente utilizadas en sensores de diversos tipos: glucómetros para diabéticos, pHmetros de laboratorio (que miden la acidez), sensores de radiación UV, etc (3). Esto se debe a que en escalas muy pequeñas, el sulfuro de cinc adquiere propiedades luminiscentes y eléctricas muy particulares que le permiten, usado correctamente, emitir luz o electricidad de manera muy sensible y eficaz en presencia un estímulo. Éste dependerá de para qué y cómo esté diseñado el sensor. Un ejemplo de ello es detectar específicamente la localización de células cancerosas. Cuando  la nanopartícula detecta una célula cancerosa, se une a ella y “emite luz”.

Esta capacidad de emitir luz es la que los hace extraordinariamente atractivos en medicina. Pueden hacerlo gracias a un proceso llamado confinamiento cuántico. Podríamos decir que es un análogo mejorado de la fluorescencia. Ésta consiste en que al darle energía a compuestos especiales, éstos la devuelven inmediatamente después aunque algo disminuida gracias a su estructura química. Un ejemplo de ello sería la quinina presente en el agua de tónica. Si esa forma de energía es la luz, la partícula emitirá luz que a pesar de tener menor energía que la suministrada, seguimos siendo capaces de detectarla.

Las partículas de pequeño tamaño, como las nanopartículas, tienen la peculiaridad de que las pérdidas de la energía suministrada son muy pequeñas y la emisión en forma de luz mucho mayor y muy fácil de detectar. A ésto es a lo que se le llama confinamiento cuántico y por ello se las denomina quantum dots. Además, como podemos ver en la imagen inferior, el color de la emisión depende del tamaño de la nanopartícula. Como veíamos en el ejemplo del ratón, es particularmente interesante esta cualidad, no solo para detectar fácilmente la emisión si no para poder detectar distintos estímulos, por ejemplo, distintos tipos celulares.

A. Mecanismo de emisión de los quantum dot B. Distintas emisiones en función del tamaño

Debido al gran interés que tiene la producción de esta nanopartícula, se ha estudiado su  síntesis en bacterias de diversos tipos. Sin embargo, poco se había estudiado de su producción por levaduras. En este sentido y conociendo la versatilidad de estos microorganismos en procesos industriales, investigadores del Central Leather Research Institute de India, han estudiado si Saccharomyces cerevisiae (la levadura del pan, la cerveza y el vino) es capaz de producir nanopartículas de sulfuro de cinc.

Lo primero que se hizo fue averiguar si la levadura era capaz de sobrevivir a la exposición a la materia prima. Para que se produzca nuestro nanomaterial, hay que suministrarle a las células una fuente de azufre y de cinc (queremos ZnS) y estas fuentes pueden afectar el crecimiento del microorganismo. En este caso, se utilizó sulfato de cinc (ZnSO₄), un suplemento común en alimentación animal y abonos. Se puso en el medio de crecimiento de las células y se observó si había crecimiento y si éste era correcto.

A. Imagen de Microscopio electrónico de Saccharomyces cerevisiae  B. Placa de cultivo de este microorganismo (1) C. Perfil de crecimiento de S. cerevisiae en presencia de materia prima (1)

En la imagen superior se observa a la izquierda una imagen de microscopía electrónica de células de la levadura. En el centro, una placa cultivo en la que ésta crece y a la derecha una representación las medidas realizadas del crecimiento, dónde la línea representa el número aproximado de células en el cultivo. En esta gráfica podemos ver que a medida que pasa el tiempo, el número de células aumenta a pesar de que el medio contenga el sulfato de cinc por lo que las células pueden vivir sin problemas y se puede pasar a investigar la producción de nanopartículas.

Con el fin de optimizar el proceso, los investigadores intentan averiguar las condiciones óptimas de crecimiento. Prueban distintas concentraciones de sustrato y de inóculo (las células que se añadirán al medio para que produzcan las nanopartículas) y tras encontrar las mejores se procede a la síntesis del producto. Tras cultivar a las células en un medio con materia prima, se monitoriza la presencia de las partículas utilizando como señal las propias propiedades ópticas de éstas. Se observa además, que tras un día de cultivo se produce el máximo de producto (como se ve en la imagen inferior a la izquierda) y que éste se encuentra en el interior de las levaduras. A las 24 horas se procede a extraer las partículas utilizando quizás uno de los métodos más sencillos de extracción. Se congelan las células a bajas temperaturas, los cristales de hielo rompen las estructuras celulares provocando que cuando se descongelan bruscamente se libere el contenido. Después, como si de una lavadora se tratara, se centrifuga, obteniendo una disolución con las partículas y descartándose los restos celulares.

Una vez obtenido el producto se procede a caracterizar sus propiedades, es decir, se quiere saber si poseen las características que las hacen tan útiles, ya que al ser producidas por un microorganismo, no se sabe si las conservan todas. Mediante técnicas de microscopía se observa la forma de las nanopartículas (imagen de la derecha). En negro se observan esferitas de distintos tamaños (30-40 nm), todas ellas como dijimos casi un millón de veces más pequeñas que un milímetro. Ésto confirma que al menos tienen el tamaño deseado. Mediante otras técnicas más avanzadas como análisis del espectro de ultravioleta, fotoluminiscencia y difracción de rayos X en polvo, se puede comprobar si la estructura interna de las partículas es la adecuada, así como su capacidad de emitir luz o sus propiedades eléctricas.

A. Perfil de producción de nanopartículas (1) B. Mecanismo de extracción C. Nanopartículas de ZnS al Microscopio electrónico de transmisión (1).

El análisis de los resultados demostró que todas las partículas mostraban las propiedades ópticas, eléctricas y luminiscentes que se buscaban. Ésto confirma por tanto, la hipótesis de los investigadores. La levadura puede sintetizar sin problemas el producto de interés apuntando además como modelo idóneo de síntesis por sus buenas cualidades como "trabajador industrial". Por otro lado, en comparación con otros microorganismos estudiados, las levaduras tienen una mayor capacidad de síntesis de nanopartículas de ZnS, probablemente debido a que su volumen celular es bastante mayor (el doble o triple que algunas bacterias) y que las reacciones que provocan la síntesis de las partículas son más potentes. Sin embargo, poco se sabe acerca de estas reacciones que ocurren en el interior de la célula por lo que se requiere más investigación sobre el tema. Cuando esta información se sepa, podríamos “enseñarle” a las levaduras cómo sintetizar más y mejores nanopartículas de ZnS, y quién sabe, quizás montar una empresa para su producción industrial.

BIBLIOGRAFÍA

1. Facile production of ZnS quantum dot nanoparticles by Saccharomyces cerevisiae MTCC 2918. Sandana Mala J, Rose C. J Biotechnol. 2014 Jan 20;170:73-8. doi: 10.1016/j.jbiotec.2013.11.017. Epub 2013 Dec 6.
2. ZnS nanostructures: From synthesis to applications. Xiaosheng Fang, Tianyou Zhai, Ujjal K. Gautam, Liang Li, Limin Wua, Yoshio Bando, Dmitri Golberg. Progress in Materials Science 56 (2011) 175–287 doi:10.1016/j.pmatsci.2010.10.001
3. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Xiaohu Gao, Yuanyuan Cui, Richard M Levenson, Leland W K Chung, Shuming Nie. Nat Biotechnol. 2004 Aug;22(8):969-76. Epub 2004 Jul 18.

TRABAJO REALIZADO POR: Clara Manzanaro Cifuentes, Sebastián Martínez López, Alba Pérez Martínez,Carla Romero Sansano, Erundina Ruiz Pérez, 

Mutantes termosensibles, de lo más útiles.

ESTUDIO DE GENES ESENCIALES EN LEVADURA

Como ya sabemos, la ciencia nos tiene acostumbrados a trabajar con mutantes a los que les hacen todo tipo de perrerías. Sin embargo, los mutantes utilizados han sido siempre muy extremistas, ¡y ya sabemos que los extremos no son buenos! En un extremo se encuentra la mutación, la cual produce un daño muchas veces irreparable en la célula tratada; mientras que en el otro podemos ver a la célula viva, sin ningún defecto. De hecho, hay veces que está célula puede ser llevada hasta la muerte, como en el caso que nos ocupa, cuando se muta genes esenciales. Por ello, en este estudio, los investigadores decidieron utilizar unas mutaciones no tan extremistas: los mutantes termosensibles.

Este nuevo tipo de mutantes poseen una característica muy especial, y es que, aunque hayan sido mutados en un gen esencial, esta mutación no se expresará a menos que la célula se encuentre en ciertas condiciones de temperatura. De esta manera, se llegó a la conclusión de que sería muy productivo utilizar un conjunto de alelos termosensibles, pero ¿de qué organismo? Lo que trata este estudio son las funciones de los genes esenciales, y qué mejor que Saccharomyces cerevisiae, un organismo en el cual muchos de estos genes son ortólogos humanos.

Perfiles de crecimiento. En esta gráfica se presentan las diferentes curvas de crecimiento de diversas cepas de S.cerevisae mutadas termosensiblemente en el mismo alelo. Se puede apreciar la variación del crecimiento a temperaturas permisivas o restrictivas. 32⁰C fue elegida como temperatura de escrutinio por su carácter restrictivo.

Así pues, el estudio en el cual nos centramos presenta la construcción y caracterización de un amplio conjunto de alelos termosensibles de los genes esenciales de S.cerevisae, recogidos en un mismo fondo genético (genetic background) como elemento innovador de la investigación. Se ha elegido este método porque este tipo de alelos proporcionan un control muy exacto de la función de los genes, ya que permite establecer condiciones permisivas y restrictivas de crecimiento con facilidad. La diferencia entre estas condiciones es que, a temperaturas permisivas el fenotipo de un mutante termosensible se asemeja al silvestre, mientras que a temperaturas restrictivas la actividad del gen esencial se reduce sustancialmente o se anula, provocando un crecimiento lento o fenotipo letal. Aquí podemos ver la clara utilidad de este tipo de mutaciones, ya que al trabajar con genes esenciales no se podría recurrir al método usual de comparación del fenotipo silvestre con el mutado, que sería letal.

Para llevar a cabo el estudio los alelos termosensibles previamente caracterizados se amplificaron mediante PCR para posteriormente integrarlos en su locus nativo, generando un conjunto de 787 mutantes termosensibles, que en total recogían 497 genes esenciales e isogénicos, excepto para el alelo termosensible introducido. Así se obtuvo un nuevo conjunto formado por 250 cepas termosensibles no solapantes entre ellas, que cubrías aproximadamente el 65% de los genes esenciales de S.cerevisae.

Una vez obtenidas las cepas termosensibles se llevaron a cabo tres técnicas para el estudio funcional de los genes esenciales: Profiling, High Content Screening y Supresión químico-genética.

El Profiling consiste en la determinación de los perfiles de crecimiento celulares, con el objetivo de establecer qué temperaturas son restrictivas y cuáles permisivas. Una vez que estos están determinados, se intenta averiguar la función de los genes esenciales de la levadura sometiendo a la célula a temperaturas restrictivas y observando en qué punto su crecimiento se ve alterado. De esta forma se puede establecer, según en qué etapa del ciclo se haya parado, la función (a grosso modo) de dicho gen. Con este método se ha observado que los alelos pertenecientes a un mismo gen presentan perfiles de crecimiento muy similares entre sí.

En esta imagen se puede observar que los alelos pertenecientes al gen DAM1 presentan perfiles de crecimiento similares entre sí, al igual que los de PRE2. Sin embargo, si se comparan los alelos de DAM1 con los de PRE2 se puede ver que no son tan parecidos.

El High Content Screening permite descubrir la función del gen mediante visualización y medidas cuantitativas de rasgos morfológicos específicos a nivel de una sola célula. Para ello se crearon dobles mutantes, es decir, cada estirpe poseía un marcador subcelular fluorescente y el alelo termosensible. Dichas estirpes se visualizaron a temperaturas entre 26⁰C y 32⁰C y se desarrolló un método para predecir la relación funcional de los genes basado en la similitud de los perfiles morfológicos fluorescentes en células.

La Supresión químico-genética trata de revertir la mutación termosensible conocida mediante compuestos químicos añadidos al cultivo una vez averiguada la posible función de genes esenciales. Por ejemplo, el Ácido Zaragózico, que inhibe una enzima (Squalene Synthase) implicada en la biosíntesis del esterol, por lo que podría utilizarse como agente reductor de lípidos.

Biosíntesis del esterol

De todos los resultados obtenidos mediante estos métodos se centraron en el papel de dos complejos proteicos esenciales en el desensamblaje del huso mitótico: cohesina y condensina. Se descubrió que cohesina y condensina son requeridas para estabilizar el CPC (complejo cromosómico pasajero) en el huso mítótico restringiendo su movimiento durante la anafase.

En conclusión, estos estudios en levaduras han comenzado a definir los principios generales de las redes genéticas, cuya comparación con genes humanos puede dar ideas sobre algunos problemas genéticos de larga data tales como la base de las enfermedades hereditarias. Estas comparaciones son posibles gracias a los análisis comparativos que revelaron que la actividad de los genes esenciales se mantiene a lo largo de grandes distancias evolutivas.

Fuente: "Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.". Zhijian Li, Franco J Vizeacoumar, Sondra Bahr, Jingjing Li, Jonas Warringer, Frederick S Vizeacoumar et al. Nature Biotechnology. April 2011.

Realizado por:

Isabel García Dasí, Pau Iborra Rico, Alejandro Pérez Domínguez, Alejandro Sanz Pérez, Eila Segarra Carrillo.

Optimización del proceso de obtención de bioetanol a partir de la paja del arroz.

Realizado por Francisco García Asencio, Daniel Carrillo Bautista, Alejandro Pardines Juan, Carla Crespo Quiles y Marina Sánchez Soler

Li et al. Bioethanol production from rice straw by a sequential use of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis with heat inactivation of Saccharomyces cerevisiae cells prior to xylose fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering, (2011), Vol 111, p: 682-686

Introducción: Estado actual del tema a presentar

En la actualidad numerosos centros de investigación están desarrollando métodos para optimizar la producción de bioetanol a partir de la paja del arroz. Esto surge a partir de la necesidad de la sustitución de los combustibles fósiles tradicionales por una fuente de combustible más sostenible.

La producción de bioetanol a partir de la paja del arroz se lleva a cabo por la fermentación alcohólica de la glucosa y la xilosa, azúcares que se obtienen a partir de la hidrólisis de lignocelulosa, presente en la pared celular de las plantas.^[1]

Hasta el momento este proceso se llevaba a cabo a partir de la fermentación conjunta de los monosacáridos nombrados mediante la aplicación simultánea de diversos microorganismos. Sin embargo, al llevar a cabo el proceso salía a la luz un problema: el rendimiento a partir de la xilosa era muy bajo, esto sucede porque existe competencia de los microorganismos por el oxígeno.^[2]

Hipótesis de trabajo

En este proyecto se propone una alternativa a la utilización de microorganismos genéticamente modificados que son una fuente de preocupación social.

Se utilizan los microorganismos Saccharomyces cerevisiae y Picchia Stipitis para la fermentación secuencial de glucosa y xilosa respectivamente. De esta forma solucionaríamos el problema del rendimiento. Además, la hidrólisis de la lignocelulosa se lleva a cabo simultáneamente con la fermentación para reducir el tiempo del proceso, hecho que produce un abaratamiento de los costes.

 Previamente a la inoculación¹ de Picchia Stipitis se han de inactivar las células² de S. cerevisiae para evitar competitividad entre ambos, aumentando así la eficiencia de la obtención de etanol a partir de xilosa y evitando además la acumulación de xilitol como producto no deseado.

Diseño experimental y resultados

La paja de arroz fue previamente tratada para crear un medio de cultivo adecuado para los microorganismos utilizados, P.stipitis y S.cerevisae. Como hemos mencionado anteriormente, es necesario inactivar S.cerevisae para obtener una mejor producción de etanol a partir de la fermentación de la xilosa por P.stipitis. A continuación, exponemos los cuatro experimentos que se desarrollaron con el fin de observar los efectos de la inactivación de S.Cerevisiae:

En el experimento número 1, inactivamos S.cerevisiae manteniéndola a 50ºC durante 6 horas y posteriormente inoculamos P.stipitis.

En el experimento 2, inoculamos P.stipitis al mismo tiempo que en el experimento anterior pero sin la previa inactivación de S.cerevisiae.

En el experimento 3, solo se inoculó S.cerevisiae sin ser inactivada, y posteriormente se añadió agua destilada que sustituiría a P.stipitis.

Por último, en el experimento 4, se realiza la inactivación de S.cerevisiae en las mismas condiciones que en el experimento 1, a 50ºC durante 6 horas, sustituyendo la inoculación de P.stipitis por agua destilada

Gráficas concentración/tiempo de glucosa, xilosa, etanol y xilitol en los 4 distintos experimentos:

Experimento 1: se observa en la gráfica que la concentración de xilosa desciende más rápidamente que en el resto de experimentos, debido a que S. cerevisiae ha sido inactivada, por lo que no establecerá competencia con P. stipitis, pudiendo ésta así sintetizar etanol de un modo más eficiente (obtenemos mayor concentración de etanol), disminuyendo la concentración de xilosa más rápidamente.

Experimento 2: se observa que la concentración de xilitol es mayor que en el resto de experimentos, debido principalmente a que la enzima que degrada este compuesto, la xilitol deshidrogenasa, funciona con oxígeno. Por consiguiente, la acción de esta enzima será menor, al tener menos oxígeno, ya que S. cerevisiae no ha sido inactivada.

Experimento 3: al no inocular P. stipitis, se observa como casi no disminuye la concentración de xilosa.

Experimento 4: se observa que la  concentración de glucosa y xilosa aumentan en el tiempo, ya que no hay nadie que las degrade. Sin embargo, cuando se ha inactivado S. cerevisiae, no hemos eliminado toda la población, una pequeña fracción sobrevive, por lo que pasado un tiempo esta población provocará la disminución en la concentración de glucosa. Contrariamente, la concentración de xilitol será muy baja, ya que no habrá ningún microorganismo que degrade la xilosa.

Fermentación de la glucosa y de la xilosa mediante S.cerevisiae y P. stipitis

En vista de los resultados anteriores se decidió llevar la investigación por el camino del primer experimento, repitiendo éste, pero en un fermentador de mayor tamaño.

Se utilizó un  medio sintético (compuesto por 50,4 g/l de glucosa, y 20,7 g/l de xilosa) para comprobar el efecto de inactivación de S. cerevisiae en la fermentación de la xilosa mediante P.stipitis. En primer lugar, se inoculó S.cerevisae en condiciones anaeróbicas a 30ºC durante 8 horas para que se produzca la fermentación de la glucosa. A continuación, se somete a las células a 50ºC durante 6 horas con el fin de inactivarlas. Una vez inactivadas se enfría el medio hasta 30ºC y se inocula la P.stipitis. Por último, se produjo la fermentación de la xilosa realizada por P.stipitis a 30ºC. Periódicamente se tomaron muestras para analizar la concentración de levaduras, azúcares, etanol y otros compuestos (como se muestra en la fig. 2).

Conclusión

Por la inactivación de las células S. cerevisiae antes de la inoculación del P. stipitis, se produjo un 23.0% más de etanol así como un 42.4% menos de xilitol. Al mismo tiempo, casi toda la xilosa (95.8%) fue fermentada. Por lo tanto los resultados de esta investigación indicaron que simplemente inactivando S. cerevisiae, la fermentación de la xilosa podría mejorarse considerablemente y el tiempo de fermentación podría reducirse también notablemente. Tras la inactivación de las células de S.cerevisiae se obtuvo un incremento en la producción de etanol, alcanzando 31 g/L de etanol en 36 horas (resultado que iguala en un 84% las producciones teóricas).

[1]: http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2009_3/Lignocelulosa.pdf

[2]: Importancia del oxígeno: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC184958/pdf/aem00092-0167.pdf

       Competencia: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/014102299190067K

1: Inocular: Introducción de las células en el medio.

2: Inactivar las células: reducir su número hasta que su presencia  sea insignificante