Mutantes termosensibles, de lo más útiles.

ESTUDIO DE GENES ESENCIALES EN LEVADURA

Como ya sabemos, la ciencia nos tiene acostumbrados a trabajar con mutantes a los que les hacen todo tipo de perrerías. Sin embargo, los mutantes utilizados han sido siempre muy extremistas, ¡y ya sabemos que los extremos no son buenos! En un extremo se encuentra la mutación, la cual produce un daño muchas veces irreparable en la célula tratada; mientras que en el otro podemos ver a la célula viva, sin ningún defecto. De hecho, hay veces que está célula puede ser llevada hasta la muerte, como en el caso que nos ocupa, cuando se muta genes esenciales. Por ello, en este estudio, los investigadores decidieron utilizar unas mutaciones no tan extremistas: los mutantes termosensibles.

Este nuevo tipo de mutantes poseen una característica muy especial, y es que, aunque hayan sido mutados en un gen esencial, esta mutación no se expresará a menos que la célula se encuentre en ciertas condiciones de temperatura. De esta manera, se llegó a la conclusión de que sería muy productivo utilizar un conjunto de alelos termosensibles, pero ¿de qué organismo? Lo que trata este estudio son las funciones de los genes esenciales, y qué mejor que Saccharomyces cerevisiae, un organismo en el cual muchos de estos genes son ortólogos humanos.

Perfiles de crecimiento. En esta gráfica se presentan las diferentes curvas de crecimiento de diversas cepas de S.cerevisae mutadas termosensiblemente en el mismo alelo. Se puede apreciar la variación del crecimiento a temperaturas permisivas o restrictivas. 32⁰C fue elegida como temperatura de escrutinio por su carácter restrictivo.

Así pues, el estudio en el cual nos centramos presenta la construcción y caracterización de un amplio conjunto de alelos termosensibles de los genes esenciales de S.cerevisae, recogidos en un mismo fondo genético (genetic background) como elemento innovador de la investigación. Se ha elegido este método porque este tipo de alelos proporcionan un control muy exacto de la función de los genes, ya que permite establecer condiciones permisivas y restrictivas de crecimiento con facilidad. La diferencia entre estas condiciones es que, a temperaturas permisivas el fenotipo de un mutante termosensible se asemeja al silvestre, mientras que a temperaturas restrictivas la actividad del gen esencial se reduce sustancialmente o se anula, provocando un crecimiento lento o fenotipo letal. Aquí podemos ver la clara utilidad de este tipo de mutaciones, ya que al trabajar con genes esenciales no se podría recurrir al método usual de comparación del fenotipo silvestre con el mutado, que sería letal.

Para llevar a cabo el estudio los alelos termosensibles previamente caracterizados se amplificaron mediante PCR para posteriormente integrarlos en su locus nativo, generando un conjunto de 787 mutantes termosensibles, que en total recogían 497 genes esenciales e isogénicos, excepto para el alelo termosensible introducido. Así se obtuvo un nuevo conjunto formado por 250 cepas termosensibles no solapantes entre ellas, que cubrías aproximadamente el 65% de los genes esenciales de S.cerevisae.

Una vez obtenidas las cepas termosensibles se llevaron a cabo tres técnicas para el estudio funcional de los genes esenciales: Profiling, High Content Screening y Supresión químico-genética.

El Profiling consiste en la determinación de los perfiles de crecimiento celulares, con el objetivo de establecer qué temperaturas son restrictivas y cuáles permisivas. Una vez que estos están determinados, se intenta averiguar la función de los genes esenciales de la levadura sometiendo a la célula a temperaturas restrictivas y observando en qué punto su crecimiento se ve alterado. De esta forma se puede establecer, según en qué etapa del ciclo se haya parado, la función (a grosso modo) de dicho gen. Con este método se ha observado que los alelos pertenecientes a un mismo gen presentan perfiles de crecimiento muy similares entre sí.

En esta imagen se puede observar que los alelos pertenecientes al gen DAM1 presentan perfiles de crecimiento similares entre sí, al igual que los de PRE2. Sin embargo, si se comparan los alelos de DAM1 con los de PRE2 se puede ver que no son tan parecidos.

El High Content Screening permite descubrir la función del gen mediante visualización y medidas cuantitativas de rasgos morfológicos específicos a nivel de una sola célula. Para ello se crearon dobles mutantes, es decir, cada estirpe poseía un marcador subcelular fluorescente y el alelo termosensible. Dichas estirpes se visualizaron a temperaturas entre 26⁰C y 32⁰C y se desarrolló un método para predecir la relación funcional de los genes basado en la similitud de los perfiles morfológicos fluorescentes en células.

La Supresión químico-genética trata de revertir la mutación termosensible conocida mediante compuestos químicos añadidos al cultivo una vez averiguada la posible función de genes esenciales. Por ejemplo, el Ácido Zaragózico, que inhibe una enzima (Squalene Synthase) implicada en la biosíntesis del esterol, por lo que podría utilizarse como agente reductor de lípidos.

Biosíntesis del esterol

De todos los resultados obtenidos mediante estos métodos se centraron en el papel de dos complejos proteicos esenciales en el desensamblaje del huso mitótico: cohesina y condensina. Se descubrió que cohesina y condensina son requeridas para estabilizar el CPC (complejo cromosómico pasajero) en el huso mítótico restringiendo su movimiento durante la anafase.

En conclusión, estos estudios en levaduras han comenzado a definir los principios generales de las redes genéticas, cuya comparación con genes humanos puede dar ideas sobre algunos problemas genéticos de larga data tales como la base de las enfermedades hereditarias. Estas comparaciones son posibles gracias a los análisis comparativos que revelaron que la actividad de los genes esenciales se mantiene a lo largo de grandes distancias evolutivas.

Fuente: "Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.". Zhijian Li, Franco J Vizeacoumar, Sondra Bahr, Jingjing Li, Jonas Warringer, Frederick S Vizeacoumar et al. Nature Biotechnology. April 2011.

Realizado por:

Isabel García Dasí, Pau Iborra Rico, Alejandro Pérez Domínguez, Alejandro Sanz Pérez, Eila Segarra Carrillo.