SEGURIDAD Y MODULACIÓN DE LA MICROBIOTA INTESTINAL POR CEPAS DE BIFIDOBACTERIUM ANIMALIS Y BIFIDOBACTERIUM LONGUM ADMINISTRADAS POR VÍA ORAL

Trabajo realizado por Luz María Agulló Chazarra, Patricia Torreblanca García, Tamara Agulló Clement y Sonia Alarcón Ferrer.

Artículo original:

N. Salazar et al. Safety and intestinal microbiota modulation by the exopolysaccharide-producing strains Bifidobacterium animalis IPLA R1 and Bifidobacterium longum IPLA E44 orallyadministered to Wistar rats. International Journal of Food Microbiology, (2011),Vol. 144, p: 342–351

1) Introducción

El tracto gastrointestinal distal funciona como un biorreactor anaerobio, integrado por unos pocos filos microbianos con una alta diversidad de especies y que median importantes funciones fisiológicas del huésped así como las transformaciones químicas de componentes no digeribles en la dieta. Esta relación simbiótica entre la microbiota intestinal y el hospedador es crucial para mantener un buen estado de salud y varios organismos han desarrollado estrategias para mantener la homeostasis.

Los probióticos están definidos como microrganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio a la salud del huésped.

En los últimos años un grupo de investigación ha estado trabajando con cepas de bifidobaterias que son capaces de producir exopolisacáridos (EPS, son polisacáridos excretados al exterior celular), que juegan un papel muy importante en el efecto probiótico de algunas cepas productoras. Los EPS sintetizados por Bifidobacterias son capaces de modificar la adhesión de los probióticos y entero-patógenos a mucosas de los humanos. También pueden ejercer un papel productor para la cepa que produce bajo condiciones adversas y se puede utilizar como sustratos fermentables por la microbiota intestinal humana.

Se ha demostrado que los EPS producidos por dos cepas de animales fueron capaces de modificar las poblaciones microbianas intestinales y que son útiles para promover cambios en la producción de ácidos grasos de cadena corta cuando se ensaya en un pH controlado, simulando las condiciones de la parte distal del intestino.

También hay que tener presentes los posibles riesgos que puede conllevar la ingesta de cepas probióticas, ya que pueden producir proteínas que favorezcan la activación de carcinógenos. Así mismo hay que tener en cuenta las posibles resistencias a antibióticos, lo cual es necesario evitar.

2) HIPÓTESIS

La hipótesis que se plantean los investigadores de este artículo es la siguiente: El uso de bifidobacterias productoras de exopolisacáridos podría ser adecuado para modular la microbiota intestinal, y por lo tanto ejercerían un beneficio para la salud.

Y, para comprobar esta hipótesis, se marcan los siguientes objetivos:

Ø Determinar si es segura la ingesta oral de las cepas B. animalis subsp. lactis IPLA R1 y B. longum subsp. longum IPLA E44, por medio de varios experimentos in vivo e in vitro.

Ø Comprobar la supervivencia de las bifidobacterias que se ingieren vía oral durante el almacenamiento del producto y durante el tránsito gastrointestinal (GIT).

Ø Evaluar la capacidad de estas cepas para modular la microbiota intestinal en un modelo animal in vivo.

3) EXPERIMENTOS Y RESULTADOS

Se utilizaron cuatro grupos de ratas:

Ø  El grupo control, con el cual se pretende conocer la microbiota natural de las ratas, antes de comenzar los experimentos. Por esta razón, este grupo sólo aparece en uno de los experimentos.

Ø  El grupo placebo, fue alimentado con leche desnatada.

Ø  El grupo B1 (alimentados con leche desnatada que contenía B. animalis lactis IPLA R1).

Ø  El grupo B2 (alimentados con leche desnatada que contenía B. longum longum IPLA E44).

1.- DETERMINAR LA SUPERVIVENCIA DE LAS CEPAS UTILIZADAS DURANTE EL ALMACENAMIENTO EN FRÍO Y EN LAS CONDICIONES DEL TRÁNSITO GASTROINTESTINAL:

               Se testó la viabilidad de las cepas de bacterias en leche desnatada a 4ºC durante 4 días (puesto que eran las condiciones de almacenamiento durante la experimentación). Los resultados fueron que la cepa R1 no perdía viabilidad, pero que la cepa E44 perdía viabilidad el 4º día de almacenamiento (pero la pérdida era mínima, por lo que no la tuvieron en cuenta).        

También, se midió la supervivencia de las bifidobacterias en condiciones que simulan el tracto gastrointestinal in vitro (Figura 1). En ambas cepas se apreció un descenso en el recuento en el GJ (jugo gástrico) a pH3. En R1 no se aprecian diferencias entre las diferentes condiciones (gráfica de abajo). En cambio, en E44 se aprecian variaciones (gráfica de arriba): en el GJ a pH2 la disminución es mucho más drástica (lo que muestra que E44 tiene una menor tolerancia a la acidez que R1). Al mezclar la cepa E44 con leche desnatada, observaron una mayor supervivencia en el GJ a pH2; lo que indica que la leche desnatada supone una protección para la cepa E44 frente a las condiciones del GIT (ya que aumenta el pH del GJ de 2 a 4).

Figura 1

2.- DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE BIFIDOBACTERIUM EN HECES Y CIEGO:

Se tomaron muestras fecales de los 3 grupos de ratas, los días 0, 4, 11, 18 y 24 (figura 2-a); y observaron que la evolución de las bifidobacterias en estas muestras fue muy similar en los 3 grupos; después de un incremento inicial en el día 4 (que estaba probablemente relacionado con los cambios en la dieta causada por la ingestión de leche) los recuentos vuelven a sus niveles iniciales en el siguiente punto de muestreo. No hay diferencias estadísticas entre los tres grupos de ratas a los 4, 11 y 18 días de alimentación, mientras que, los recuentos de Bifidobacterium fueron significativamente mayores después de 24 días en las heces de las ratas de los grupos B1 y B2 que en las heces de las ratas del grupo placebo.

En cuanto a los resultados obtenidos en el análisis del contenido del ciego (figura 2-b), los recuentos de B. animalis respecto al grupo placebo no mostraron ningún cambio significativo al final del tratamiento con respecto a los valores iniciales (Día 0, en el grupo control), mientras que los recuentos de B. longum se redujeron significativamente. También observaron que los niveles totales de bifidobacterias en el ciego de las ratas de los grupos B1 y B2, después de 24 días de la administración de probióticos, fueron relativamente más alta que en el de las ratas del grupo placebo.

Con este experimento, pudieron concluir que el tratamiento con las cepas R1 y E44 promueve niveles ligeramente superiores de Bifidobacterias en el ciego y las heces de las ratas.

Figura 2

3.- DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE MICROORGANISMOS EN HECES Y CIEGO:

Determinaron las huellas genéticas de la microbiota del ciego de 4 ratas de cada grupo (cada banda representa un tipo de microorganismo distinto), y vieron que no se podía establecer un patrón relacionado con la administración oral de las cepas de bifidobacterias, ya que cada rata presentaba una huella genética específica (figura 3-a). Es decir, había variabilidad inter- e intra-grupos.

      Sin embargo, sí que observaron que había una mayor diversidad de microorganismos en las ratas del grupo B1 que en las ratas de los otros 2 grupos (figura 3-b). Lo cual nos indica que la ingesta de la cepa R1 no sólo provoca un aumento de la cantidad de microorganismos, sino que también aumenta su variabilidad.

Figura 3

4.- EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD DE LAS CEPAS UTILIZADAS:

Durante el transcurso de la experimentación no se observó muerte de los animales, ni variaciones anormales en la ingesta de alimentos o agua, ni un comportamiento inesperado. Y tampoco se observan variaciones significativas en el peso del animal.

Además, los recuentos totales de anaerobios no difieren significativamente entre ellos para cualquier tejido analizado, lo que indica que la administración oral de estos microorganismos no promueve la translocación bacteriana. Las imágenes de la figura 4 muestran los resultados de las pruebas histopatológicas, en las que se aprecia que no hay cambios significativos entre los grupos.

Figura 4

Además, se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de ocho antibióticos (gentamicina, kanamicina, la estreptomicina, la neomicina, tetraciclina, eritromicina, clindamicina y cloranfenicol) y los resultados obtenidos fueron los esperados para las bifidobacterias. También se determinó la presencia de genes de resistencia a tetraciclina, que codifican proteínas ribosómicas de protección. Se descubrió que la cepa E44 no presentaba resistencia a tetraciclina, pero sí que lo hacía la cepa R1.

5.- DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN AGCC EN HECES Y CIEGO:

La actividad metabólica de la microbiota intestinal se determinó midiendo la concentración de AGCC en las heces y en el contenido de las muestras del ciego (tabla 1). Los AGCC son ácidos grasos de cadena corta que son el producto de la fermentación de la fibra alimentaria soluble por la microbiota intestinal. Son un importante substrato energético de las células de la mucosa gastrointestinal y para las células del colon. Los principales AGCC son el acetato, el butirato y el propionato.

La concentración de AGCC total detectado en las heces se incrementó durante el tratamiento, en los tres grupos de ratas, con respecto a los niveles iniciales, aunque no se encontró una variación importante en las proporciones de AGCC (70% acetato, 13% propionato y 17% butirato). En cuanto a la comparación entre los tres grupos de ratas, la concentración del total AGCC fue significativamente más alta en los animales alimentados con bifidobacterias que en el grupo placebo.

El perfil AGCC obtenido en las muestras del contenido del ciego fue notablemente diferente al de las heces. En contraposición a la encontrada en las heces, las comparaciones de los tres grupos de las ratas mostraron que las concentraciones de AGCC totales fueron significativamente menor en ratas alimentadas con las cepas de bifidobacterias que en el grupo placebo. Las proporciones también cambiaron (aunque el propionato se mantuvo como el componente menos abundante): 44% acetato, 18% propionato y 37% butirato. 

Tabla 1

4) DISCUSIÓN

Tal y como se ha visto, las bajas temperaturas disminuyen la viabilidad de la cepa E44, pero no demasiado, por lo que no es un impedimento. Las cepas utilizadas tienen una mayor supervivencia en el tránsito intestinal, aunque la cepa R1 es más resistente a las condiciones ácidas que la cepa E44 (esta sensibilidad a la acidez se soluciona administrando la cepa con leche).

La salud de las ratas que ingirieron las cepas no se vio afectada. Además, no se apreció un traslado de las bacterias a otros órganos, ya que los recuentos microbianos realizados dieron el resultado esperado o un poco menor. Además, se apreció que el nivel de B. animalis en el ciego de las ratas se mantuvo durante el tratamiento, mientras que el de B. longum decreció, lo que sugiere que la ingesta de leche desnatada por parte de las ratas favoreció a la población de B. animalis y perjudicó la permanencia en el tracto de B. longum. De igual forma, la ingesta de probióticos, prebióticos y simbióticos promueve el aumento en la población de bifidobacterias en el tracto digestivo de las ratas.

En general, los valores de resistencia a los antibióticos están dentro de lo esperado para las bifidobacterias. Aunque se determinó que la cepa R1 es resistente a la tetraciclina.

Se encontró, en las ratas pertenecientes a los grupos alimentados con bifidobacterias, una mayor producción de metabolitos necesarios para mantener unas condiciones adecuadas en el colon respecto al grupo alimentado con placebo, lo que indica que las bifidobacterias podrían mejorar su producción. Además, se encontró una actividad de las cepas utilizadas que alivia los síntomas de la intolerancia a la lactosa.

La conclusión que se extrae de este artículo es que los datos experimentales corroboran la seguridad de las cepas utilizadas en los experimentos y sugieren que su ingesta podría ser beneficioso para la salud (aunque no hay evidencias tan claras como para afirmarlo).