Adaptación de las bacterias lácticas al Butanol

ADAPTACIONES LÁCTICAS AL BUTANOL

Autores del trabajo:           

Ramón Quiles, Alfredo López, Isaac García, Rocío González, Javier Rivera.

INTRODUCCIÓN:

Debido a un suministro limitado y al aumento de la carga medioambiental dentro de la sociedad actual. La producción de combustibles a partir de materias primas renovables se ha convertido en un tema de prioridad mundial.

El Butanol ha sido reconocido como un buen candidato para cubrir este puesto, siendo un biocombustible superior, que producen algunos organismos como parte de su metabolismo y en un tiempo prudencialmente corto.

El butanol se produce, junto con acetona y etanol, por fermentación anaeróbica en el caso de bacterias Gram-positivas (particularmente especies del género Clostridium), dicha fermentación puede realizarse a partir de diferentes materias primas de origen agrícola.

Aún hoy existen diversas barreras que reducen la rentabilidad de la producción de Butanol, entre ellas encontramos la baja eficiencia fermentativa con materias primas baratas y alto grado de toxicidad del butanol para las colonias productoras del mismo. Por lo tanto, y a pesar de que necesitamos de una alta tasa de producción de butanol para rentabilizar el sistema, a mayor producción de butanol, menor desarrollo de las colonias productoras y un posterior decrecimiento de la misma producción. 

La tolerancia en las cepas microbianas empleadas no superaba el 2% de concentración de Butanol en el medio, cuando es necesaria una concentración algo mayor para comenzar a rentabilizar la producción del mismo. Esto ha llevado a varios investigadores a trabajar y estudiar otros organismos y encontrar uno que sea más tolerante que los hasta ahora empleados.

ESTUDIO

El objetivo del presente estudio fue evaluar la tolerancia a distintas concentraciones de butanol en el medio de una colección de bacterias lácticas aisladas de plantas de producción de etanol. Además, estas cepas fueron sometidas a una creciente concentración de butanol en los medios de cultivo para mejorar su tolerancia a esta sustancia. Aquí presentamos estos estudios para obtener y aislar cepas tolerantes al butanol.

1: Material y métodos 

• .  Se extrajeron diversas muestras de colonias bacterianas procedentes de plantas productoras de etanol.

1.2 . Para la identificación del fenotipo de interés (resistencia a concentraciones mayores de Butanol) se emplearon una serie de pruebas de origen comercial, y se comenzaron a aislar las diferentes colonias seleccionadas.

1.3 . Se llevó a cabo un proceso de adaptación-aclimatación muy lento bajo estrictas condiciones anaerobias. Los cultivos bacterianos fueron inoculados en la SRA. complementado con un 2%, 3% y 4% butanol y se incubaron a 37ºC en condiciones anaeróbicas. El crecimiento fue supervisado midiendo  la densidad óptica de cada cultivo. Los cultivos fueron transferidos al cultivo con un 2% y una vez que los cultivos demostraron crecimiento con un solo nivel de concentración de butanol (unos 68 cultivos), se comenzó el cambio a cultivos con un 3%. Después de 20 aclimataciones, los cultivos seleccionados fueron inoculados en la SRA. con 3 %butanol (prueba que solo pasaron 18 cultivos)… Y así hasta llegar al 4% de concentración.

1.4 . Las colonias más aptas para crecer en una concentración del 4% de butanol en el medio (unas 10) fueron seleccionadas y crecidas en un cultivo con esa concentración. Estos cultivos se mantuvieron con éxito durante una semana. Se realizaron 3 repeticiones y se pasó a analizar los resultados.

Análisis de Resultados

Una vez obtenidas las 10 cepas que superaron la prueba con el 4% de concentración en butanol, tuvieron que aplicar diversos métodos para averiguar a que especie pertenecían. Estos métodos fueron:

• El API 50 CH  que consta de 50 pocillos con una parte aerobia para la oxidación y/o asimilación de compuestos y otra anaerobia para la fermentación. A estos pocillos se les añaden  las bacterias a identificar y  diversos compuestos como azúcares en distintas proporciones (según el numero del pocillo). Dependiendo que compuestos finales se obtengan y que rutas metabólicas se utilicen, los cambios en el Ph, etc,  se puede identificar al microorganismo en cuestión.  

El otro método consiste en secuenciar un trozo del adn ribosomal de la bacteria para así poder asociarla a una especie en concreto.

Los organismos fueron identificados:

Los cultivos más tolerantes fueron el NE L 0206-31 y NE-L 0206-47 fueron identificadas por la API 50 CHL como pediococcus pediococcus parvulus y Lactobacillus crispatus, respectivamente. Los otros 8 aislamientos fueron identificados por 16 rDNA sequencing: NE-L 0206-19 fue identificada como Lactobacillus amylovorus, BR0216-18 como Weissella confused, y los seis cultivos restantes BR0605-3, BR0605-B15, BR0713-18, BR0713-20, BR0713-30, y BR0713-33 se identificaron como Lactobacillus mucosa.

Sólo cambiando las condiciones anaerobias pudimos identificar variedades tolerantes a altas concentraciones de Butanol. El hecho de que los rasgos tolerantes se encontraron en especies de lactobacilos sugirió que las variedades tolerantes pueden poseer las vías concretas para compensar el estrés generado por el butanol o singulares membranas/paredes celulares para proteger las estructuras de daño celular causado por el butanol. También es posible que determinadas señales se activen debido al estrés generado por la acción del butanol producioendo que la proteínas se coordinen para conferir cierta tolerancia al butanol.

¿Porqué eran más aptos estos organismos para soportar mayores concentraciones de Butanol?

Para comprobar si esta tolerancia se debía a una tolerancia determinada por sus genes o por otras razones, se escogieron las 5 cepas más tolerantes, tal y como las colectaron de las productoras de etanol y en un medio de cultivo se les inoculó un 4% de Butanol directamente.

Solo dos cepas soportaron este cambio obteniendo crecimiento a lo largo de 7 días, se trataba de dos cepas de Lactobacillus mucosae. Se obtuvo un crecimiento muy lento, pero a pesar de todo, apreciable, frente al resto de cepas, que tras 7 días no presentaron crecimiento alguno.

Durante este estudio de tolerancia se vio que el resto de cepas, con una adaptación más lenta, eran capaces de soportar esta concentración por una serie de mecanismos diversos, entre ellos un cambio en la composición de los ácidos grasos de membrana (con un consiguiente aumento de su fluidez). Era necesario conocer estos mecanismos para poder identificar los genes responsables de esta tolerancia a altas concentraciones de butanol y poder crear, por ingeniería genética microorganismos productores-tolerantes de Butanol. La idea era obtener Lactobacillum mucosae capaces de producir butanol, para conseguir un organismo que rentabilizase la producción de dicho combustible.

Fig. 1. Prueba de corto plazo el estrés butanol. Las cepas seleccionadas de las cepas originales de las plantas de etanol NE-L0206-19 (amylovorus Lactobacillus), BR0216-18 (Weis-turca confusa) y BR0315-B4 (Lactobacillus johnsonii) y BR0713-30 (mucosa Lactobacillus) , y BR0713-33 (mucosas Lactobacillus) se sembraron en placas de agar MRS y las colonias individuales se inocularon en caldo MRS suplementado con 4% butanol. Los cultivos se mantuvieron durante una semana y OD600 valores fueron graficados contra el tiempo whenOD600 lecturas fueron tomadas en el caldo de cultivo mismo. Tres experimentos se llevaron a cabo y los valores medios se presentaron.

VERSIÓN GRUPO ARA

ADAPTATIONS TO BUTANOL LÁCTIC

Authors of work: Ramón Quiles, Alfredo López, Isaac García, Rocío González, Javier Rivera.

Introduction:

Due to limited supply and increasing the environmental burden in the society. The production of fuels from renewable raw materials has become a priority issue worldwide.

Butanol has been recognized as a good candidate to fill this position, being a superior biofuel, produced by some organisms as part of their metabolism and in a short time prudently. The butanol is produced, along with acetone and ethanol by anaerobic fermentation in the case of Gram-positive bacteria (especially species of the genus Clostridium), said fermentation can be made from different raw materials of agricultural origin.

Even today there are several barriers that reduce the profitability of the production of butanol, among them we find the low efficiency with inexpensive raw materials fermentation and high toxicity of butanol for producing colonies of the same. Therefore, despite that need a high rate of production of butanol to recoup the system, increased production of butanol, lower development of the colonies producing and a subsequent decrease in the same production. Tolerance in microbial strains used did not exceed 2% concentration of butanol in the middle, when you need a somewhat higher concentration to start the production of it profitable. This has led some researchers to work and study other organizations and find one that is more tolerant than the hitherto employed.

STUDY

The aim of this study was to evaluate the tolerance to different concentrations of butanol in the middle of a collection of lactic acid bacteria isolated from ethanol production plants. Furthermore, these strains were subjected to an increasing concentration of butanol in the culture media for tolerance to it. We present these studies to obtain and isolate butanol tolerant strains.

1: Material and methods

1.1. Samples were extracted several bacterial colonies from ethanol-producing plants.

1.2. To identify the phenotype of interest (resistance to higher concentrations of butanol) were used a series of tests of commercial origin, and began to isolate the different colonies selected.

1.3. He took out a process of slow adaptation, acclimatization under strict anaerobic conditions. Bacterial cultures were inoculated in MRS. supplemented with 2%, 3% and 4% butanol and incubated at 37 ° C under anaerobic conditions. Growth was monitored by measuring the optical density of each culture. The cultures were transferred to culture with 2% and once with growth cultures showed a single level of concentration of butanol (about 68 cultures), began to change crops with 3%. After 20 acclimatizations, selected cultivars were inoculated in MRS. with 3% butanol (test only took 18 crops) ... And so on up to 4% concentration.

1.4. Colonies more apt to grow at a concentration of 4% of butanol in the medium (about 10) were selected and grown in culture with this concentration. These cultures were successfully maintained for one week. There were 3 replications and went on to analyze the results.

ANALYSIS OF RESULTS

After obtaining the 10 stocks that passed the test with 4% butanol concentration had to use various means to find out which species they belonged. 

These methods were:       

• The API 50 CH consisting of 50 wells with an aerobic part for oxidation and / or assimilation of compounds and other anaerobic for fermentation. These wells are added to identify bacteria and various compounds such as sugars in various proportions (based on the number of wells). Depending on which final compounds are obtained and that metabolic pathways are used, changes in pH, etc., can identify the organism in question.

• The other method is to sequence a piece of the ribosomal DNA of the bacteria in order to associate a particular species.

The organisms were identified:

The cultures were more tolerant NE and NE-L 0206-31 L 0206-47 were identified by the API 50 CHL as Pediococcus Pediococcus parvulus and Lactobacillus crispatus, respectively. The other 8 isolates were identified by 16 rDNA sequencing: NE-L 0206-19 was identified as Lactobacillus amylovorus, BR0216-18 as Weissella confused, and the six remaining crops-3 BR0605, BR0605-B15-18 BR0713, BR0713-20 , BR0713-30, and BR0713-33 were identified as Lactobacillus mucosa.Only by changing the anaerobic conditions we could identify varieties tolerant to high concentrations of butanol. The fact that the tolerant features were found in species of lactobacilli tolerant varieties suggested that may possess the specific means for compensating the stress generated by the butanol or unique membranes / cell walls to protect the structures of cellular damage caused by butanol. It is also possible that certain signals are activated due to stress generated by the action of butanol producioendo that the proteins are coordinated to confer some tolerance to butanol.

Why these organisms were more apt to withstand higher concentrations of butanol?

To check whether this tolerance was determined by a tolerance genes or for other reasons, the 5 strains were chosen more tolerant as those collected from the ethanol and producing in a culture medium were inoculated with 4% butanol directly. Only two strains endured this change getting growth over 7 days, there were two strains of Lactobacillus mucosae. It was a very slow growth, but nevertheless significant, compared to other strains, after 7 days did not grow at all. During this tolerance study was that the remaining strains, with a slower adaptation, were able to withstand this concentration for a number of different mechanisms, including a change in composition of fatty acids from membrane (with a consequent increase of fluency). It was necessary to understand these mechanisms to identify the genes responsible for this tolerance to high concentrations of butanol and to create genetically engineered microorganisms producing butanol-tolerant.

Figure 1. Short-term test butanol stress. Selected strains of the original strains of ethanol plants NE-L0206-19 (Lactobacillus amylovorus), BR0216-18 (Weis-Turkish confusing) and BR0315-B4 (Lactobacillus johnsonii) and BR0713-30 (Lactobacillus mucosa), and BR0713 -33 (mucous Lactobacillus) were plated onto MRS agar and individual colonies were inoculated in MRS broth supplemented with 4% butanol. Cultures were maintained for a week and OD600 values ​​were plotted against time whenOD600 readings were taken at the same broth. Three experiments were conducted and mean values ​​were presented.