“Effect of fermentation temperature on validamycin A production by Streptomyces hygroscopicus 5008”

Efecto de la temperatura de fermentación en la producción de Validamicina A por Streptomyces hygroscopicus 5008.

Artículo:  “Effect of fermentation temperature on validamycin A production by Streptomyces hygroscopicus 5008”
Publicado en la revista: Journal of Biotechnology número 142 del año 2009 (páginas 271- 274).
Autores: Yueqiao Liao, Zhen-Hua Wei, Linquan Bai, Zixin Deng, Jian- Jiang Zhong.

1.       INTRODUCCIÓN

En el este de Asia, existe una enfermedad en el cultivo de arroz llamado “tizón de la vaina” producido por un hongo. La validamicina A (VAL-A), producida por Streptomyces hygroscopicus es un importante agroantibiótico antifúngico. En este trabajo, el efecto de la temperatura de fermentación en la biosíntesis de VAL-A fue investigada entre 28˚C-42˚C, se concluyó que un rango interesante de temperaturas para esta producción se encuentra entre 35˚C-37˚C. Los tres operones, valABC, valKLMN y valG, para los ocho genes necesarios para la producción de validamicina A, fueron activados cuando la temperatura alcanzaba el umbral. La actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) de la ruta de las pentosas fosfato y ValG de la biosíntesis de Val-A fueron también mejoradas a una alta temperatura de cultivo.

La enfermedad  tizón de la vaina de arroz presenta la sintomatología hacia finales del ciclo del cultivo. Se produce el marchitamiento y secado de hojas quedando adheridas al tallo. Cuando el cultivo ya se encuentra senescente, se hace visible el signo del patógeno, representado por hileras de puntos negros sobre el tallo, que son los cuerpos de fructificación del hongo.

Rhizoctonia solani, el hongo causante de la enfermedad, puede sobrevivir en el suelo durante muchos años en forma de esclerocios. Los esclerocios de Rhizoctonia tienen gruesas capas externas que permiten la supervivencia y funcionan como la estructura de hibernación del patógeno. En algunos casos raros el patógeno también puede tomar la forma de micelio que reside en el suelo. El hongo es atraído a la planta por estímulos químicos liberados por la planta en crecimiento y/o el residuo de descomposición de la planta.

El proceso de penetración en un huésped se puede lograr de diferentes maneras. La entrada puede ocurrir a través de la penetración directa en la cutícula de la planta/epidermis o por medio de aberturas naturales en la planta. Las hifas entrarán en contacto con la planta y se unirán por medio del crecimiento, penetrando en la célula de la planta permitiendo al patógeno obtener los nutrientes.  El patógeno también puede liberar enzimas que descomponen las paredes celulares de la planta, y continúa para colonizar y crecer dentro del tejido muerto. Esta ruptura de las paredes celulares y la colonización del patógeno en el huésped es lo que forma el esclerocio. Un nuevo inóculo se produce en o dentro del tejido huésped, y un nuevo ciclo se repite cuando se dispone de nuevas plantas.

El ciclo de la enfermedad comienza  durante el invierno. El esclerocio/micelio se encuentra en los restos en descomposición de plantas, en el suelo o en plantas huéspedes.  Las hifas jóvenes y basidios en fructificación  emergen y producen micelio y basidiosporas.  La producción de basidiosporas en germinación penetran en el estoma mientras que el micelio se sitúa sobre la superficie de la planta y secreta las enzimas necesarias en la planta con el fin de iniciar la invasión de la planta huésped. Después de invadir con éxito al huésped, se forma necrosis y esclerocios en y alrededor del tejido infectado que entonces conduce a los diversos síntomas asociados con la enfermedad, tales como la pudrición del suelo y del tallo… y el proceso comienza de nuevo.

Validacin es un efectivo fungicida-bactericida de origen natural, cuyo ingrediente activo es la validamicina A, producida por Streptomyces hygroscopicus 5008. Inhibe la trehalasa,  una enzima presente en la mayoría de los seres vivos, pero que es inhibida con mayor efectividad en hongos. Esta inhibición bloquea la reacción que oxida la trehalosa en dos glucosas. Esto  afecta a la digestión y al transporte de glucosa a las puntas de las hifas, deteniendo su crecimiento, por tanto el micelio no puede afectar a la planta. Por un lado, al no producir glucosa se acumula la trehalosa, provocando el hinchamiento de las células por un efecto higroscópico (capacidad de algunas sustancias de absorber o ceder humedad al medio ambiente). Por otro lado, al no producirse glucosa, no se puede producir una sustancia que forma parte de la membrana (fosfatioinositol), con lo que ésta queda afectada y detiene el crecimiento de las puntas de las hifas.

2.       MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo y análisis de fermentación

Las esporas de S. hygroscopicus 5008 fueron almacenadas, activadas y cultivadas para luego ser recogidas en seis duplicados, uno para cada condición de temperatura.

Para determinar la concentración de proteína intracelular, se centrifugó el micelio, se lavó y luego se distribuyó a dos tubos Eppendorf, añadiendo lisozima a uno de los tubos para la lisis de las células. El método estándar de Bradford se utilizó para determinar la proteína liberada por el micelio, utilizando el colorante azul de Coomasie G-250 se puede observar que todas aquellas proteínas existentes en la muestra se tiñen de color azul. Para poder utilizar este método se requiere realizar una curva de calibración o curva estándar, con soluciones de proteínas de concentración conocida, a las cuales se les mide la absorbancia en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 595 nm para luego finalmente poder cuantificarlas. Los residuos de azúcar se determinaron por el método colorimétrico fenol-sulfúrico, que gracias a la reacción que produce azúcares simples, fenol y ácido sulfúrico se obtiene como resultado un color amarillo, naranja. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de carbohidratos presente por lo que se puede cuantificar los azúcares midiendo la absorbancia. Y finalmente la cantidad de VAL-A producida se midió por HPLC; con esta técnica se consigue separar los componentes de una mezcla ya que se basa en los diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias a analizar y la columna cromatográfica.

RNA y análisis de RT-PCR cuantitativa

Los niveles de transcripción de los genes valABC, valKLMN y valG fueron determinados por RT-PCR cuantitativa que corresponde a una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.

Se utiliza para ello los Eppendorf Mastercycler Realplex con One Step PrimeScript-RT-PCR Kit. Las reacciones de control fueron fijadas mediante la adición de RNA sin transcripción inversa en lugar de cDNA. Después de pre-desnaturalizar a 95°C durante 5 min, la amplificación se va a producir en dos pasos: 15 s 95°C para desnaturalizar y 30 s a 60°C para el alineamiento y la elongación y todo este proceso durante 40 ciclos.

Determinación de actividades enzimáticas de ValG

La actividad ValG se analizó de la siguiente manera: La mezcla de reacción (100 µl) con 25 mM Tris–HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 20 mM NH₄Cl, UDP-glucosa de 15 mM, 10 mM validoxylamine A y 2µl de la solución de enzima fue incubada durante 3 h a 30°C, 35°C, 37°C y 42°C, respectivamente, en consonancia con su temperatura de fermentación. Posteriormente, se añadieron 100 µl de cloroformo para detener la reacción y la proteína fue retirada. La actividad enzimática se determinó midiendo la cantidad de VAL-A transformada a partir de validoxylamine por HPLC. La concentración de la proteína de la solución de enzima se determinó por el método estándar de Bradford.

3.       RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como es bien sabido, la síntesis de las proteínas está directamente relacionada con la regulación y expresión de los genes responsables de su producción y la actividad enzimática de las reacciones que la llevan a cabo.

Por ello, el experimento se realizó a tres niveles (cinética de la síntesis proteica, expresión génica y actividad enzimática) relacionados con la producción de validamicina A.

Velocidad de producción

Además de estudiar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de acumulación de la validamicina A, también observaron que la temperatura afectaba a otros factores, como la producción de proteínas intracelulares o el pH.

Proteínas intracelulares

Observaron que en la etapa inicial (hasta 16 horas), la velocidad de acumulación de proteínas intracelulares era mayor a altas temperaturas (37⁰C a 42⁰C). Sin embargo, en la etapa intermedia (hasta 48 horas), la velocidad de síntesis era  mayor a temperaturas inferiores (entre 28⁰C y 35⁰C). Finalmente, en la etapa tardía (hasta 120 horas), la producción a altas temperaturas disminuía considerablemente.

Los resultados que obtuvieron se muestran en la siguiente gráfica:

 Validamicina A

Al igual que en las demás proteínas, en la etapa inicial se observó un aumento de la velocidad de producción a temperaturas altas, sin embargo, este aumento era visible también en la etapa intermedia. En la etapa tardía, la velocidad disminuía a altas temperaturas.

Es destacable la diferencia en las velocidades a las temperaturas de 35⁰C y 37⁰C, lo que conllevó a definir que la temperatura umbral para incrementar considerablemente la producción era la de  37⁰C.

Variación del pH

Una temperatura alta durante la etapa inicial también causa efectos sobre el pH, aumentándolo.

Expresión génica

Para estudiar la expresión de los genes relacionados con la síntesis de Val-A (valABC, valKLMN y valG) se disgregaron las células de Streptomyces hygroscopicus y se purificó su ARN con el método del Trizol y eliminando el ADN con la DNasa I. A partir de este ARN se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa a tiempo real para determinar el grado de expresión de los genes nombrados.

Se observó un aumento en el grado de expresión de estos genes al elevar la temperatura de 35⁰C a 37⁰C en las etapas inicial e intermedia, coincidiendo con el aumento en la producción de validamicina A.

Además la elevada expresión de valABC  y valKLMN  en la etapa inicial a 42⁰C concuerda con una mayor producción del agente antifúngico.

Actividad enzimática

Hay que tener en cuenta que la temperatura tiene un papel importante no sólo a nivel transcripcional, sino también a nivel post-transcripcional. Por ello, se estudió la actividad de dos enzimas: la G6PDH, por su importante función en la ruta de las pentosas fosfato, y la valG, por participar en la última etapa de síntesis de la validamicina A.

En cuanto a la G6PDH, en la ruta de las pentosas fosfato produce un precursor para la biosíntesis del antibiótico, la sedoheptulosa 7-fosfato (S7P). Una elevada temperatura en la etapa inicial aumenta la actividad de la G6PDH y, sin embargo, en la etapa siguiente produce una disminución de la misma. En la etapa tardía apenas se detecta actividad.

Por otro lado, un incremento en la temperatura aumenta la actividad de valG en la etapa inicial, pero hay que tener en cuenta que, en la etapa intermedia el aumento sigue, excepto cuando la temperatura alcanza  los 42⁰C.

4.       CONCLUSIÓN

El incremento de temperatura aumenta la actividad de los genes implicados en la síntesis de Val-A, la actividad de G6PDH (y la ruta PP) y de valG. Todo ello conlleva a una mayor producción de validamicina A.

En conclusión, conociendo la ruta de biosíntesis de la validamicina A (o de cualquier otro compuesto) y los factores que la afectan, se pueden modular para incrementar la producción.

Componentes del grupo: Beatriz García Alonso, Adela Bernabeu Zornoza, Carla Navarro Quiles, Magdalena Nikolaeva Koleva y María Poveda Deltell.