Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


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sábado, 25 de mayo de 2013

New method for isolating antibiotic-producing fungi


Autores: Mio Kawaguchi, Kenichi Nonaka, Rokuro Masuma y Hiroshi Tomoda.

Componentes del grupo: Abdelmonim Bernia, Nuria Castejón Navarro, Ainoa Gallego Zaragoza, Carlos Hernández Cortés y Niurka Martínez Morales.



    1.- INTRODUCCIÓN

Es bien sabido que los hongos siguen siendo una de las fuentes más importantes para el descubrimiento de  nuevos  compuestos  bioactivos.  De  la  historia  del  descubrimiento de  fármacos a partir de microorganismos, los metabolitos secundarios de los hongos han proporcionado un importante número de fármacos, tales como el antibiótico penicilina, el inmunosupresor c y los agentes antihipercolesterolémicos lovastatina y compactina.

La Etnomicología podría definirse como el estudio de los usos de los hongos por las diversas culturas; ya que los hongos son organismos  que  desde  siempre  han  sido  empleados  para  los  más diversos y extraños menesteres.

El cuerpo humano alberga normalmente una gran variedad de microorganismos que incluyen bacterias  y  hongos.  Entre  estos, algunos  son  útiles  para  el  cuerpo, otros  no  producen  ni  daño  ni beneficio y unos cuantos pueden provocar síntomas, a veces, dañinos. Este último, es el caso del microorganismo de interés: Candida albicans, que es una  levadura que  vive  en  casi todas partes, incluyendo el cuerpo humano. Se encuentra   normalmente en pequeñas cantidades en la vagina, la boca, el tubo digestivo y en la piel; y, por lo general, el sistema inmunológico mantiene los hongos bajo control.

Muchos de estos antibióticos han sido descubiertos a partir de microorganismos, por  un proceso que incluye varias etapas:

1) Aislamiento de microorganismos principalmente del suelo (2-3 días).
2) Purificación de los cultivos de los microorganismos aislados (3-5 días).
3) Identificación de los microorganismos aislados principalmente por características morfológicas para eliminar cepas duplicadas (14-21 días).
4) Comprobación   de si los caldos de cultivo o extractos de microorganismos que muestran actividad antimicrobiana para seleccionar microorganismos candidatos que produzcan antibióticos (7-8 días).
5) Resuspensión de los microorganismos seleccionados para obtener la reproductibilidad de la actividad antimicrobiana (6-8 días).

Este proceso rutinario (llamado en este estudio “método tradicional”) lleva normalmente 5-7 semanas. Lo que pretende este estudio es mostrar un método más eficiente y rápido para seleccionar los hongos que puedan producir antibióticos anti-Candida albicans.


     2.- MATERIAL Y MÉTODOS

Medios para el aislamiento de hongos
 
            Se usaron cuatro medios para el aislamiento de hongos de las muestras de suelo y se añadió kanamicina a todos para proteger las muestras contra el crecimiento de bacterias ajustados a pH 6,0 antes de la esterilización.

           En el método A las muestras de suelo se pusieron en una placa de plástico y cada uno de los cuatro medios se fundieron para ser vertido en las placas, mezclándose bien para dispersar la muestra; se produjo un rápido crecimiento de hongos como Trichoderma, Aspergillus y Penicillium inhibiendo el crecimiento de otros hongos.

           En el método B las muestras de suelo muy diluidas se suspendieron en tampón Winogradsky. Por este método de revestimiento se aislaron las colonias de hongos como las especies Virgaria y Humicola, de crecimiento lento.

           Ambos métodos fueron usados para preparar las placas de suelo que fueron incubadas a 27°C durante 2-3 días para formar colonias fúngicas.

           El  objetivo  fundamental  de  este  estudio  fue  observar  directamente  el  crecimiento  de  las colonias de hongos derivadas de las muestras de suelo que mostraban efectos antagónicos para el crecimiento de C. albicans.


 Inoculación de C. albicans en placas de suelo

           Se probaron para ello 5 métodos de inoculación de C. albicans:

   - En  el método I, C.  albicans y  la  muestra de suelo se  mezclaron e  incubaron al  mismo tiempo.
   - En el método II, C. albicans se preparó en primer lugar en un medio de agar; y la placa que contenía la muestra de suelo en agar se puso encima y se incubó a continuación.

           En estos dos métodos, C. albicans patógena y el hongo derivado del suelo, comenzaron a crecer al mismo tiempo obteniéndose, como resultado, un recubrimiento de la placa  con C. albicans (figura 1a) porque creció mucho más rápido que la muestra de suelo, los cuales no pudieron formar colonias. Ello supuso que no se pudieran observar efectos antagonistas en las placas.

   - En  el  método  III,  C.  albicans  se  extendió  en  las  placas  de  suelo,  después  de  que formasen  colonias  tras  2-3  días  a  27°C.  Desafortunadamente, C.  albicans  no  creció  de manera uniforme en la placa (figura 1b).
    - En el método IV, Las muestras de suelo se extendieron sobre la placa de C. albicans después estas últimas formaran colonias (2-3 días de incubación a 27°C); sin embargo, las muestras de suelo al crecer no quedaron repartidas de forma uniforme por la placa de C. albicans (figura 1c).



     Establecimiento del método de inoculación V

           Para establecer este método, se estudió la concentración de  C. albicans que debía poseer la suspensión para  pulverizar la  placa, así como el proceso de formación de  los derivados fúngicos del suelo.

           El atomizador usado en este estudio puede pulverizar una solución de 40 μl. Se probaron cinco concentraciones diferentes de suspensiones de  C.  albicans para pulverizar en la placa de suelo y se comparó el crecimiento de C. albicans después de 1-3 días de incubación a 27ºC.

           La figura 2 muestra que las colonias de C. albicans pulverizadas en la placa de agar (sin muestra de suelo), tras un día de la inoculación, crecieron rápidamente. Se puede deducir,  pues, que una incubación de un día era suficiente para que C. albicans pudiera formar colonias,  siendo las más adecuadas para el estudio las obtenidas en las placas (C) y (D).





      Más tarde, las placas del  suelo se  prepararon por el  método de  recubrimiento A o  B y se incubaron a 27ºC   y, después   de 2 o 3 días de incubación para formar las colonias,  la suspensión de C. albicans se pulverizó sobre las mismas, dentro de una bolsa de plástico instalada en la campana (figura 3). Tras un día de incubación a 27ºC, se seleccionaron las colonias que mostraban efectos antagónicos sobre el crecimiento de C. albicans (figura 4).



  Identificación taxonómica del hongo

         La identificación taxonómica se llevó a cabo mediante la observación de la disposición de los conidióforos y la forma en que se produjeron las esporas, y por el crecimiento del hongo en agar.


  Ensayo de la actividad anti-C.albicans

            Para confirmar la producción de antibióticos anti-fúngicos por cepas seleccionadas, se inoculó con un asa de siembra las cepas de LCA en un tubo de prueba que contenía uno de los medios (1-4). El tubo sería incubado en un agitador rotatorio a 27ºC durante 6 días. Posteriormente, se midió la actividad anti-C. albicans por el método de difusión en agar usando discos de papel.



3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN

             Se vio que la inoculación de C. albicans por los métodos I – IV no eran adecuados para el propósito final; por lo que, se ensayó otro método para superponer C. albicans en una placa de suelo por pulverización (método de inoculación V).

Taxonomía de las 26 cepas seleccionadas

     Los resultados de la taxonomía de las 26 selecciones, se observan en la siguiente tabla:


             En este estudio, se ha establecido un método eficaz y rápido para un aislamiento directo de hongos a partir de muestras de suelo que pueden producir antibióticos anti C. albicans. Para ello se dispersó por pulverización después de que las colonias derivadas del suelo se hubieran formado en las placas (en 2 o 3 días). Después de un día de incubación, se seleccionaron las colonias que mostraban un efecto antagónico en el crecimiento de C. albicans.

           De esta forma, en una semana, se seleccionaron 151 hongos candidatos de 18 muestras de suelo y, de entre ellos, 26 hongos mostraron actividad anti-C. albicans en sus caldos de cultivo.
           Como se resume en la tabla 1, Penicillium fue el género seleccionado que más antifúngico produce y fue el más aislado (16/26), seguido de Trichoderma (3/26).

           Por lo tanto, este método permite obtener productores de antibióticos de hongos procedentes del  suelo en un tiempo más corto (2 semanas vs.  5-7 semanas) y con una tasa mayor (17,2% frente a 3,1%) que el método tradicional.




4.-CONCLUSIÓN

             En este estudio se ha conseguido obtener un método más eficaz y rápido para el aislamiento de hongos con actividad antifúngica. Cabría esperar que este método sea aplicable para el aislamiento de microorganismos derivados del suelo (hongos y actinomicetos de rápido/lento crecimiento) que muestren efectos antagonistas en otros microorganismos patógenos.       

          Se obtendría así una optimización de los resultados en un periodo de tiempo más corto gracias a los avances científicos y tecnológicos; lo cual supondría un mayor aprovechamiento del tiempo en la resolución de problemas y/o búsqueda de tratamientos/soluciones a los mismos. Además de un mayor ahorro a la hora de mantener los cultivos.



Referencia Bibliográfica: The Jounal of Antibiotics (2013) 66, 17-21

2 comentarios:

  1. La primera vez que se nombra a una especie hay que poner todo su nombre: Candidad albicans

    Posteriormente, puede usarse la abreviatura en el género, pero todo debe de ir en cursiva. Es decir: C. albicans

    No se debe de usar la 1ª persona cuando se describe el trabajo de otras personas.

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  2. Ya se han corregido los errores.

    Un saludo.

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