Autores: Mio
Kawaguchi, Kenichi Nonaka, Rokuro Masuma y Hiroshi Tomoda.
Componentes del grupo:
Abdelmonim Bernia, Nuria Castejón Navarro, Ainoa Gallego Zaragoza, Carlos
Hernández Cortés y Niurka Martínez Morales.
Palabras
clave: Compuesto bioactivo, metabolitos secundarios, etnomicología, antifúngico, Candida albicans, inoculación.
1.- INTRODUCCIÓN
Es bien sabido
que los hongos siguen siendo una de las fuentes más importantes para el
descubrimiento de nuevos compuestos
bioactivos. De la
historia del descubrimiento de fármacos a partir de microorganismos, los
metabolitos secundarios de los hongos han proporcionado un importante número de
fármacos, tales como el antibiótico penicilina, el inmunosupresor c y los
agentes antihipercolesterolémicos lovastatina y compactina.
La Etnomicología
podría definirse como el estudio de los usos de los hongos por las diversas
culturas; ya que los hongos son organismos
que desde siempre
han sido empleados
para los más diversos y extraños menesteres.
El cuerpo humano
alberga normalmente una gran variedad de microorganismos que incluyen
bacterias y hongos.
Entre estos, algunos son
útiles para el
cuerpo, otros no producen
ni daño ni beneficio y unos cuantos pueden provocar
síntomas, a veces, dañinos. Este último, es el caso del microorganismo de interés: Candida albicans, que es una
levadura que vive en
casi todas partes, incluyendo el cuerpo humano. Se encuentra normalmente en pequeñas cantidades en la
vagina, la boca, el tubo digestivo y en la piel; y, por lo general, el sistema
inmunológico mantiene los hongos bajo control.
Muchos de estos
antibióticos han sido descubiertos a partir de microorganismos, por un proceso que incluye varias etapas:
1)
Aislamiento de microorganismos principalmente del suelo (2-3 días).
Este proceso
rutinario (llamado en este estudio “método tradicional”) lleva normalmente 5-7
semanas. Lo que pretende este estudio es mostrar un método más eficiente y
rápido para seleccionar los hongos que puedan producir antibióticos
anti-Candida albicans.
2.- MATERIAL Y MÉTODOS
Medios para el aislamiento de hongos
En el método A las muestras de suelo se pusieron en una placa de
plástico y cada uno de los cuatro medios se fundieron para ser vertido en las
placas, mezclándose bien para dispersar la muestra; se produjo un rápido
crecimiento de hongos como Trichoderma, Aspergillus y Penicillium inhibiendo el
crecimiento de otros hongos.
En el método B las muestras de suelo muy diluidas se suspendieron en
tampón Winogradsky. Por este método de revestimiento se aislaron las colonias
de hongos como las especies Virgaria y Humicola, de crecimiento lento.
Ambos métodos fueron usados para preparar las placas de suelo que fueron
incubadas a 27°C durante 2-3 días para formar colonias fúngicas.
El objetivo fundamental
de este estudio
fue observar directamente
el crecimiento de las
colonias de hongos derivadas de las muestras de suelo que mostraban efectos
antagónicos para el crecimiento de C. albicans.
Inoculación de C. albicans en placas de suelo
Se probaron para ello 5 métodos de inoculación de C. albicans:
-
En el método I, C. albicans y
la muestra de suelo se mezclaron e
incubaron al mismo tiempo.
En estos dos métodos, C. albicans patógena y el hongo derivado del
suelo, comenzaron a crecer al mismo tiempo obteniéndose, como resultado, un
recubrimiento de la placa con C.
albicans (figura 1a) porque creció mucho más rápido que la muestra de suelo,
los cuales no pudieron formar colonias. Ello supuso que no se pudieran observar
efectos antagonistas en las placas.
-
En el
método III, C.
albicans se extendió
en las placas
de suelo, después
de que formasen colonias
tras 2-3 días a 27°C.
Desafortunadamente, C.
albicans no creció
de manera uniforme en la placa (figura 1b).
Establecimiento del método de inoculación V
Para establecer este método, se estudió la
concentración de C. albicans que debía
poseer la suspensión para pulverizar
la placa, así como el proceso de
formación de los derivados fúngicos del
suelo.
El atomizador usado en este estudio puede
pulverizar una solución de 40 μl. Se probaron cinco concentraciones diferentes
de suspensiones de C. albicans para pulverizar en la placa de suelo
y se comparó el crecimiento de C. albicans después de 1-3 días de incubación a
27ºC.
La figura 2 muestra que las colonias de C.
albicans pulverizadas en la placa de agar (sin muestra de suelo), tras un día
de la inoculación, crecieron rápidamente. Se puede deducir, pues, que una incubación de un día era
suficiente para que C. albicans pudiera formar colonias, siendo las más adecuadas para el estudio las
obtenidas en las placas (C) y (D).
Más tarde, las placas del suelo se
prepararon por el método de recubrimiento A o B y se incubaron a 27ºC y, después
de 2 o 3 días de incubación para formar las colonias, la suspensión de C. albicans se pulverizó
sobre las mismas, dentro de una bolsa de plástico instalada en la campana
(figura 3). Tras un día de incubación a 27ºC, se seleccionaron las colonias que
mostraban efectos antagónicos sobre el crecimiento de C. albicans (figura 4).
Identificación taxonómica del hongo
La identificación taxonómica se llevó a
cabo mediante la observación de la disposición de los conidióforos y la forma
en que se produjeron las esporas, y por el crecimiento del hongo en agar.
Ensayo de la actividad anti-C.albicans
Para confirmar la producción de antibióticos anti-fúngicos por cepas
seleccionadas, se inoculó con un asa de siembra las cepas de LCA en un tubo de
prueba que contenía uno de los medios (1-4). El tubo sería incubado en un
agitador rotatorio a 27ºC durante 6 días. Posteriormente, se midió la actividad
anti-C. albicans por el método de difusión en agar usando discos de papel.
3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se vio que la inoculación de C. albicans por los métodos I – IV no eran
adecuados para el propósito final; por lo que, se ensayó otro método para
superponer C. albicans en una placa de suelo por pulverización (método de
inoculación V).
Taxonomía de las 26 cepas seleccionadas
Los resultados de la taxonomía de las 26 selecciones, se observan en la
siguiente tabla:
En este estudio, se ha establecido un método eficaz y rápido para un
aislamiento directo de hongos a partir de muestras de suelo que pueden producir
antibióticos anti C. albicans. Para ello se dispersó por pulverización después
de que las colonias derivadas del suelo se hubieran formado en las placas (en 2
o 3 días). Después de un día de incubación, se seleccionaron las colonias que
mostraban un efecto antagónico en el crecimiento de C. albicans.
De esta forma, en una semana, se seleccionaron 151 hongos candidatos de
18 muestras de suelo y, de entre ellos, 26 hongos mostraron actividad anti-C.
albicans en sus caldos de cultivo.
Por lo tanto, este método permite obtener productores de antibióticos de
hongos procedentes del suelo en un
tiempo más corto (2 semanas vs. 5-7
semanas) y con una tasa mayor (17,2% frente a 3,1%) que el método tradicional.
4.-CONCLUSIÓN
En este estudio se ha conseguido obtener un método más eficaz y rápido
para el aislamiento de hongos con actividad antifúngica. Cabría esperar que
este método sea aplicable para el aislamiento de microorganismos derivados del
suelo (hongos y actinomicetos de rápido/lento crecimiento) que muestren efectos
antagonistas en otros microorganismos patógenos.
Se obtendría así una optimización de los resultados en un periodo de
tiempo más corto gracias a los avances científicos y tecnológicos; lo cual
supondría un mayor aprovechamiento del tiempo en la resolución de problemas y/o
búsqueda de tratamientos/soluciones a los mismos. Además de un mayor ahorro a
la hora de mantener los cultivos.
Referencia
Bibliográfica: The Jounal of Antibiotics (2013) 66, 17-21
Autores: Mio
Kawaguchi, Kenichi Nonaka, Rokuro Masuma y Hiroshi Tomoda.
Componentes del grupo:
Abdelmonim Bernia, Nuria Castejón Navarro, Ainoa Gallego Zaragoza, Carlos
Hernández Cortés y Niurka Martínez Morales.
Palabras
clave: Compuesto bioactivo, metabolitos secundarios, etnomicología, antifúngico, Candida albicans, inoculación.
1.- INTRODUCCIÓN
Es bien sabido
que los hongos siguen siendo una de las fuentes más importantes para el
descubrimiento de nuevos compuestos
bioactivos. De la
historia del descubrimiento de fármacos a partir de microorganismos, los
metabolitos secundarios de los hongos han proporcionado un importante número de
fármacos, tales como el antibiótico penicilina, el inmunosupresor c y los
agentes antihipercolesterolémicos lovastatina y compactina.
La Etnomicología
podría definirse como el estudio de los usos de los hongos por las diversas
culturas; ya que los hongos son organismos
que desde siempre
han sido empleados
para los más diversos y extraños menesteres.
El cuerpo humano
alberga normalmente una gran variedad de microorganismos que incluyen
bacterias y hongos.
Entre estos, algunos son
útiles para el
cuerpo, otros no producen
ni daño ni beneficio y unos cuantos pueden provocar
síntomas, a veces, dañinos. Este último, es el caso del microorganismo de interés: Candida albicans, que es una
levadura que vive en
casi todas partes, incluyendo el cuerpo humano. Se encuentra normalmente en pequeñas cantidades en la
vagina, la boca, el tubo digestivo y en la piel; y, por lo general, el sistema
inmunológico mantiene los hongos bajo control.
Muchos de estos
antibióticos han sido descubiertos a partir de microorganismos, por un proceso que incluye varias etapas:
1)
Aislamiento de microorganismos principalmente del suelo (2-3 días).
2)
Purificación de los cultivos de los microorganismos aislados (3-5 días).
3)
Identificación de los microorganismos aislados principalmente por
características morfológicas para eliminar cepas duplicadas (14-21 días).
4)
Comprobación de si los caldos de
cultivo o extractos de microorganismos que muestran actividad antimicrobiana
para seleccionar microorganismos candidatos que produzcan antibióticos (7-8
días).
5)
Resuspensión de los microorganismos seleccionados para obtener la
reproductibilidad de la actividad antimicrobiana (6-8 días).
Este proceso
rutinario (llamado en este estudio “método tradicional”) lleva normalmente 5-7
semanas. Lo que pretende este estudio es mostrar un método más eficiente y
rápido para seleccionar los hongos que puedan producir antibióticos
anti-Candida albicans.
2.- MATERIAL Y MÉTODOS
Medios para el aislamiento de hongos
Se usaron cuatro medios para el aislamiento de hongos de las muestras de
suelo y se añadió kanamicina a todos para proteger las muestras contra el
crecimiento de bacterias ajustados a pH 6,0 antes de la esterilización.
En el método A las muestras de suelo se pusieron en una placa de
plástico y cada uno de los cuatro medios se fundieron para ser vertido en las
placas, mezclándose bien para dispersar la muestra; se produjo un rápido
crecimiento de hongos como Trichoderma, Aspergillus y Penicillium inhibiendo el
crecimiento de otros hongos.
En el método B las muestras de suelo muy diluidas se suspendieron en
tampón Winogradsky. Por este método de revestimiento se aislaron las colonias
de hongos como las especies Virgaria y Humicola, de crecimiento lento.
Ambos métodos fueron usados para preparar las placas de suelo que fueron
incubadas a 27°C durante 2-3 días para formar colonias fúngicas.
El objetivo fundamental
de este estudio
fue observar directamente
el crecimiento de las
colonias de hongos derivadas de las muestras de suelo que mostraban efectos
antagónicos para el crecimiento de C. albicans.
Inoculación de C. albicans en placas de suelo
Se probaron para ello 5 métodos de inoculación de C. albicans:
-
En el método I, C. albicans y
la muestra de suelo se mezclaron e
incubaron al mismo tiempo.
-
En el método II, C. albicans se preparó en primer lugar en un medio de agar; y
la placa que contenía la muestra de suelo en agar se puso encima y se incubó a
continuación.
En estos dos métodos, C. albicans patógena y el hongo derivado del
suelo, comenzaron a crecer al mismo tiempo obteniéndose, como resultado, un
recubrimiento de la placa con C.
albicans (figura 1a) porque creció mucho más rápido que la muestra de suelo,
los cuales no pudieron formar colonias. Ello supuso que no se pudieran observar
efectos antagonistas en las placas.
-
En el
método III, C.
albicans se extendió
en las placas
de suelo, después
de que formasen colonias
tras 2-3 días a 27°C.
Desafortunadamente, C.
albicans no creció
de manera uniforme en la placa (figura 1b).
-
En el método IV, Las muestras de suelo se extendieron sobre la placa de C.
albicans después estas últimas formaran colonias (2-3 días de incubación a
27°C); sin embargo, las muestras de suelo al crecer no quedaron repartidas de
forma uniforme por la placa de C. albicans (figura 1c).
Establecimiento del método de inoculación V
Para establecer este método, se estudió la
concentración de C. albicans que debía
poseer la suspensión para pulverizar
la placa, así como el proceso de
formación de los derivados fúngicos del
suelo.
El atomizador usado en este estudio puede
pulverizar una solución de 40 μl. Se probaron cinco concentraciones diferentes
de suspensiones de C. albicans para pulverizar en la placa de suelo
y se comparó el crecimiento de C. albicans después de 1-3 días de incubación a
27ºC.
La figura 2 muestra que las colonias de C.
albicans pulverizadas en la placa de agar (sin muestra de suelo), tras un día
de la inoculación, crecieron rápidamente. Se puede deducir, pues, que una incubación de un día era
suficiente para que C. albicans pudiera formar colonias, siendo las más adecuadas para el estudio las
obtenidas en las placas (C) y (D).
Más tarde, las placas del suelo se
prepararon por el método de recubrimiento A o B y se incubaron a 27ºC y, después
de 2 o 3 días de incubación para formar las colonias, la suspensión de C. albicans se pulverizó
sobre las mismas, dentro de una bolsa de plástico instalada en la campana
(figura 3). Tras un día de incubación a 27ºC, se seleccionaron las colonias que
mostraban efectos antagónicos sobre el crecimiento de C. albicans (figura 4).
Identificación taxonómica del hongo
La identificación taxonómica se llevó a
cabo mediante la observación de la disposición de los conidióforos y la forma
en que se produjeron las esporas, y por el crecimiento del hongo en agar.
Ensayo de la actividad anti-C.albicans
Para confirmar la producción de antibióticos anti-fúngicos por cepas
seleccionadas, se inoculó con un asa de siembra las cepas de LCA en un tubo de
prueba que contenía uno de los medios (1-4). El tubo sería incubado en un
agitador rotatorio a 27ºC durante 6 días. Posteriormente, se midió la actividad
anti-C. albicans por el método de difusión en agar usando discos de papel.
3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se vio que la inoculación de C. albicans por los métodos I – IV no eran
adecuados para el propósito final; por lo que, se ensayó otro método para
superponer C. albicans en una placa de suelo por pulverización (método de
inoculación V).
Taxonomía de las 26 cepas seleccionadas
Los resultados de la taxonomía de las 26 selecciones, se observan en la
siguiente tabla:
En este estudio, se ha establecido un método eficaz y rápido para un
aislamiento directo de hongos a partir de muestras de suelo que pueden producir
antibióticos anti C. albicans. Para ello se dispersó por pulverización después
de que las colonias derivadas del suelo se hubieran formado en las placas (en 2
o 3 días). Después de un día de incubación, se seleccionaron las colonias que
mostraban un efecto antagónico en el crecimiento de C. albicans.
De esta forma, en una semana, se seleccionaron 151 hongos candidatos de
18 muestras de suelo y, de entre ellos, 26 hongos mostraron actividad anti-C.
albicans en sus caldos de cultivo.
Como se resume en la tabla 1, Penicillium fue el género seleccionado que
más antifúngico produce y fue el más aislado (16/26), seguido de Trichoderma
(3/26).
Por lo tanto, este método permite obtener productores de antibióticos de
hongos procedentes del suelo en un
tiempo más corto (2 semanas vs. 5-7
semanas) y con una tasa mayor (17,2% frente a 3,1%) que el método tradicional.
4.-CONCLUSIÓN
En este estudio se ha conseguido obtener un método más eficaz y rápido
para el aislamiento de hongos con actividad antifúngica. Cabría esperar que
este método sea aplicable para el aislamiento de microorganismos derivados del
suelo (hongos y actinomicetos de rápido/lento crecimiento) que muestren efectos
antagonistas en otros microorganismos patógenos.
Se obtendría así una optimización de los resultados en un periodo de
tiempo más corto gracias a los avances científicos y tecnológicos; lo cual
supondría un mayor aprovechamiento del tiempo en la resolución de problemas y/o
búsqueda de tratamientos/soluciones a los mismos. Además de un mayor ahorro a
la hora de mantener los cultivos.
Referencia
Bibliográfica: The Jounal of Antibiotics (2013) 66, 17-21
La primera vez que se nombra a una especie hay que poner todo su nombre: Candidad albicans
ResponderEliminarPosteriormente, puede usarse la abreviatura en el género, pero todo debe de ir en cursiva. Es decir: C. albicans
No se debe de usar la 1ª persona cuando se describe el trabajo de otras personas.
Ya se han corregido los errores.
ResponderEliminarUn saludo.