UTILIZACIÓN DE LA TÉCNICA FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL LACTOBACILLUS SPP. EN LECHE FRESCA

¿Cómo identificar y cuantificar la cantidad de microorganismos probióticos en alimentos? 

Palabras clave: Fluorescence in situ hybridization (FISH), sonda PNA (Peptide nucleic acid),Lactobacillus spp. , probióticos . 

Los probióticos son microorganismos vivos añadidos a alimentos, que permanecen activos en el intestino ejerciendo importantes efectos fisiológicos, tales como la digestión y fermentación de sustancias beneficiosas, o la secreción de sustancias que impiden el crecimiento de especies patógenas. Pese a que recientes estudios han cuestionado los posibles beneficios causados por estos microorganismos, éstos son utilizados en gran cantidad de productos lácteos, destacando sobretodo el género Lactobacillus. 

La importancia que se le confiere a estos microorganismos ha sido la causa del estudio realizado por un grupo de investigadores (Almeida et al.) bajo el título: Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification of Lactobacillus spp. in milk samples. El objetivo de este estudio ha sido la creación de una sonda (Lac 663) específica de cepas de Lactobacillus que junto con la técnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) permita la cuantificación directa de Lactobacillus spp. en concentraciones a las cuales estas bacterias probióticas tienen un efecto beneficioso para la salud humana. 

Para la identificación de estas comunidades microbianas, cabe destacar, que anteriormente se utilizaban técnicas de cultivo, mucho más lentas a la hora de obtener los resultados, y costosas. Actualmente se han desarrollado técnicas moleculares que nos aportan información más completa de la comunidad total de bacterias y son más eficaces y rápidas. 

Una de las técnicas más utilizadas y ,precisamente ,la que se emplea en este experimento es la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) que se basa en la hibridación de sondas marcadas, específicas para las regiones de cada taxón de los ribosomas bacterianos, que son detectadas , posteriormente, mediante microscopía de fluorescencia. 

Generalmente para este tipo de técnicas se suele utilizar sondas de ADN pero debido al bajo número de ribosomas en las células, la difícil permeabilización celular y la presencia de estructuras secundarias y terciarias de ARNr, surgen las sondas de ácido nucleico peptídico (PNA) que son las que precisamente utiliza el grupo de investigadores de Almeida. 

El procedimiento experimental seguido por los investigadores con el fin de diseñar, caracterizar y evaluar una nueva sonda de PNA marcada con fluorescencia fue el siguiente:

1.-Diseño de la sonda de PNA, Lac 663

Para el diseño de la sonda, cuyo objetivo es la identificación del género Lactobacillus, se utilizó el programa Primrose y bases de datos de ARNr 16s (Ribosomal Database Project II). Las razones seguidas para su diseño fueron alta complementariedad par las secuencias diana y baja complementariedad para las secuencias no diana. Una vez obtenida la secuencia peptídica se le unió a su N-terminal una molécula de Alexa Fluor 488, para la posterior detección con el microscopio de fluorescencia. 

2.1- Evaluación teórica de la especificidad y sensibilidad de la sonda

Primeramente se realizó una evaluación teórica de la especificidad y sensibilidad de la sonda. Para ello se utilizaron programas informáticos como la base de datos de ARNr 16s mediante los cuales se comprobó la gran especificidad de la sonda Lac663 frente a anteriores sondas diseñadas por otros grupos de investigadores, con fines similares.

La sonda Lac663 tenía, como se observó, mayor especificidad y sensibilidad, 99,66% y 91,52% respectivamente. Además se esperaba de la sonda de PNA un menor número de falsos positivos y, por lo tanto, una mejor aplicabilidad en el análisis de muestras complejas como es la leche fresca, que puede estar contaminada por diversas especies bacterianas. Esto se recoge en la siguiente tabla:

También cabe destacar que la sonda en cuestión era más corta que el resto de las estudiadas, lo que asegura una mejor penetración en la pared celular y una mayor discriminación de desajustes puntuales en las bases nitrogenadas. 

2.2.-Evaluación experimental de la especificidad y sensibilidad de la sonda

En primer lugar se realizó un estudio de la eficiencia de la sonda utilizando 36 cepas del género Lactobacillus, 20 cepas pertenecientes al orden de los Lactobacillales y algunos patógenos en la industria alimentaria. El resultado fue, en términos generales, una hibridación óptima con gran parte de las cepas de Lactobacillus; mientras que en el resto de las cepas se obtuvo una hibridación ausente o pobre, como se observa en la siguiente tabla: 

Las cepas bacterianas utilizadas en ensayos de PNA-FISH en el presente estudio. La eficiencia de la sonda: (-) hibridación ausente; (+) hibridación pobre; (+ +) hibridación moderada (+ + +) hibridación buena, y (+ + + +) hibridación óptima. La tabla muestra el valor promedio de los tres experimentos para cada cepa.

Posteriormente con el microscopio de fluorescencia y la utilización de distintos filtros se comprobó que, efectivamente, la sonda hibridaba solamente con el género Lactobacillus.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de Lactobacillus spp .después del periodo de hibridación con la sonda PNA (Lac 663) asociada a una molécula de Alexa Fluor 488. 

(a)Filtro verde (b) Filtro rojo: L14 L. curvatus L34, L. sakei, E02, S. thermophilus, E04, L. mesenteroides, E06, E. faecium. 

3.-Validación de la sonda PNA en muestras de leche fresca

Tras haber comprobado la especificidad y sensibilidad de la sonda in silico y experimentalmente, ésta se adaptó para detectar y cuantificar muestras de leche fresca. El sistema de detección límite fue establecido, según Ishibashi y Shimamura, en 1x10^7 UFC/ml (unidad formadora de colonias/ml). Se determinó la concentración por dos métodos el muestreo convencional y el PNA FISH. En esta última técnica el recuento fue superior a la CFU, probablemente por la presencia de células no cultivables, como se muestra en la siguiente tabla:

Además, se hizo otro experimento en una leche contaminada con otras cepas que no eran de Lactobacillus. No se observó una hibridación inespecífica con estas cepas.

El estudio se comparó con otras técnicas usadas para la detección de bacterias en muestras industriales, como la epifluorescencia, ARDRA( Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis ) y RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) o qPCR. No obstante éstas técnicas resultaron ser inespecifícas caras y costosas, incapacitaban la numeración de lactobacilos o podría ser inhibida por sustancias presentes en la muestra, respectivamente.

Finalmente se concluyó que la sonda Lac663 era una sonda PNA específica y sensible de Lactobacillus y junto con FISH era una técnica rápida y fiable para la detección y cuantificación de lactobacilos probióticos en matrices complejas. Sólo las muestras de leche con un número eficaz de bacterias muestran resultados correspondientes. 

Referencias bibliográficas: 

International Journal of Food Microbiology 162 (2013) 64–70

Autores del artículo: Antonio Machado , Carina Almeida , Ana Carvalho , Filip Boyen , Freddy Haesebrouck , Ligia Rodrigues ,Nuno Cerca , Nuno Filipe Azevedo.

Autoras del trabajo: Natalia Gómez, Carolina Orjuela, Anna Quirant, Susana Torres, Amaya Vara.