La producción eficaz de ácido L-láctico a partir de xilosa por una cepa recombinante de Candida utilis

Introducción:

El objetivo de la siguiente investigación pretende conseguir una producción eficiente de ácido L-Láctico a partir de xilosa mediante la utilización de levaduras, en este caso de Candida utilis. Esta cepa es deficiente en piruvato descarboxilasa (necesaria para nuestro fin), por lo que mediante ingeniería genética se obtuvo una cepa recombinante. Ésta era capaz de aumentar la producción de ácido L-Láctico,al conseguir que prefiriese el NADH-xilosa reductasa a la NADPH como la XR nativa.

Experimento: 


Convencionalmente se han utilizado bacterias del ácido láctico para la producción del mismo, pero el interés en especies de levadura como microorganismos alternativos en la producción de ácido láctico ha aumentado, debido a que éstas son más resistentes a un pH bajo. Por ello,  se creó una cepa de levadura recombinante que expresa una lactato deshidrogenasa exógena (LDH) y produce ácido láctico, sin embargo, su productividad es mucho menor que en bacterias.

En otro intento por lograr el objetivo se cogió a Saccharomyces cerevisiae, que al ser una levadura, realiza fermentación alcohólica y no láctica, por lo que el aumento en la producción de alcohol debía de suprimirse. Para ello, los genes que codifica la piruvato descarboxilasa (PDC) se interrumpieron, de forma que se obtuvieron cepas de S. cerevisiae con una mayor producción de ácido láctico, pero esta interrupción causó un defecto en el crecimiento.

Llegados a este punto se buscó un organismo que fuera capaz de utilizar la xilosa eficientemente y degradarla hasta ácido L-Láctico. La ruta a seguir fue observada primero en hongos, por lo que se estudiaron sus mecanismos enzimas,… y se buscaron levaduras con características similares. Hay especies de levaduras que podían ser utilizadas y estaban divididas en tres grupos, el primero, Saccharomyces cerevisiae, no podía metabolizar xilosa natural debido a la falta de enzimas catabólicas adecuadas. El segundo grupo, Candida utilis, podía crecer en xilosa, pero no la fermentaba. Y el tercer grupo, Pichia stipitis y Shehatae candida, podía producir etanol a partir de xilosa.

Las cepas de Saccharomyces cerevisiae modificadas genéticamente producían grandes cantidades de xilitol gracias a su mejora pero en realidad solo servía para producir etanol a partir de xilosa, pero no ácido L-Láctico. La primera información que llegó sobre la producción de ácido L-láctico a partir de xilosa fue de una cepa de P.stipitis genéticamente modificada, que expresa la Lactato deshidrogena (LDH). Por otro lado se encontró una cepa de C. utilis modificada deficiente en PDC y activa para LDH que mostraba una elevada producción de ácido L-Láctico aunque no a partir de xilosa.

Recientemente, se había informado sobre una cepa recombinante de C. utilis que mostraba una preferencia por el NADH, al expresar una proteína XR (xilosa reductasa) de C. shehatae previamente mutada para aumentar su eficiencia (mXR). A esta cepa de C.utilis seguidamente se le introdujo la proteína de C. shehatae XDH (xilitol dehidrogenasa) y a continuación la XK (xilulosaquinasa) de P. stipitis. Aparte se le añadió los plásmidos pVT164 y pVT168 que contienen los genes para dichas proteínas y además el gen de la higromicina B como marcador seleccionable. Dando la cepa mXR/XDH/XK.

En resumen, en la cepa se suprimió el gen que codifica el PDC1 y en su lugar había dos copias del gen Llactato deshidrogenasa (L-LDL) de Bos Taurus, de forma que se trataba de una cepa transformada de Candida utilis y una cepa libre de marcadores perteneciente a Pj0957.
Seguidamente se analizaron los efectos sobre la producción del ácido láctico en términos de especificidad:

                 A continuación, se midieron las actividades enzimáticas, que se refiere a la cantidad de enzima que oxida o reduce un mol de NADP o NADPH por minuto. Las cepas de las que se disponía eran Pj0957, XR/XDH/XK, y mXR/XDH/XK, todas ellas fueron cultivadas en un medio YPD5 (10g/L de extracto de levadura, 20g/L de peptona, y 50g/L de glucosa) o YPX5 (10g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona y 50g/L de xilosa) durante 24 horas a 30oºC y posteriormente se inocularon en un medio de fermentación y se realizaron una serie de pasos que dieron lugar a los siguientes resultados.

Las actividades enzimáticas de las cepas XR/XDH/XK y mXR/XDH/XK que expresan alelos heterólogos de CsheXR, CsheXDH y PsXK eran mucho más altos que los de la cepa control (Pj0957) cultivadas en YPX5.
La actividad XR de la cepa recombinante expresando CsheXR K275R/N277D (MXR / XDH / XK) fue mayor en el presencia de NADH, y menor en la presencia de NADPH en comparación con una cepa que expresa inicialmente CsheXR (XR / XDH / XK). No hubo diferencia significativa entre las cepas de levadura recombinantes de la tasa de de crecimiento de células en YPX5.

Los resultados obtenidos por XR / XDH / XKormXR / XDH / XK indicaban un consumo mucho más elevado de xilosa en comparación con la cepa de control Pj0957. En la cepa XR / XDH / XK se observó una mayor producción L-ácido láctico al igual que una elevada concentración de xilitol frente al control, mientras que la cepa MXR / XDH / XK aunque produjo una elevada cantidad de L-ácido láctico, bajó en su acumulación de xilitol. Durante esta parte del ensayo no se observó una concentración significativa de etanol, glicerol y ácido acético. De estos resultados se dedujo que el NADH producido durante la reducción de xilosa y xilitol aumentaba significativamente la producción de L-ácido láctico a partir de la xilosa.

Seguidamente se observó el efecto de la temperatura sobre la fermentación, obteniéndose que la mayor producción de L-ácido láctico con MXR / XDH / XK a 35ºC. También se buscó incrementar la producción con la utilización de células precultivadas en dos medios diferentes (YPD5 y YPX5) obteniéndose una mayor producción en YPX5 aunque con unos rendimientos no muy diferentes entre sí, por lo que se pensó que podía estar causado por la adaptación a la xilosa.

Los cambios en la expresión de la proteína endógena inducida por el medio de pre-cultivo que contenía xilosa podría aumentar la tasa de producción de ácido L-láctico, porque no se observaron diferencias significativas en la actividad de las enzimas en células MXR / XDH / XK cuando se cultivan tanto en YPD5 y en YPX5 (Tabla 1).

Obteniendo que los transportadores de xilosa de baja afinidad y de alta afinidad se expresan en C. utilis cultivadas en glucosa y xilosa, respectivamente. 

Estos cambios preliminares en la expresión de genes (transportadores de xilosa) inducidos por el medio de cultivo podían acortar el tiempo de fermentación en MXR/XDH/XR.

La respiración de C. utilis no estaba reprimida en medios ricos en glucosa (a diferencia de S. cerevisiae), por lo tanto sus células podían crecer vigorosamente en condiciones aeróbicas.
La cepa de ingeniería de C. utilis con medio de xilosa, poseía genes capaces de fermentarla, se trataba del HXR/XDH/XR, que poseían CsheXR (que prefiere NADH), una CsheXDH y una PsXK. 

Otro dato importante que se obtuvo es el hecho de que no había una acumulación significativa ni de etanol, ni glicerol ni de ácido acético (se muestra en la Tabla 2).
Estas levaduras tenían tolerancia al pH bajo y eran capaces de obtener ácido L-láctico en este pH. 

Conclusión y resultados: 

Después de todo, se obtuvo, con C. utilis, un rendimiento del 70,8% cuando se creció en medio mínimo (6,7g/L de nitrógeno y 100g/L de glucosa) a pH 3,4. Todos estos resultados indicaban que el uso de la cepa de ingeniería de levadura tenía varias ventajas respecto al de las bacterias y se espera llegar al uso adicional de levaduras transgénicas.

Artículo original:

Efficient production of L-lactic acid from xylose by a recombinant Candida utilis strain 
Autores: Hideyuki Tamakawa, Shigehito Ikushima, and Satoshi Yoshida 
Journal of Bioscience and Bioengineering VOL. 113 No. 1, 73–75, 2012 



Trabajo realizado por: Clara Díaz, Ana Navarro, Maribel Ramos, Àngela Soler y Anaïs Tomás